固体基材上の少なくとも１つのプロトン化基を含む分子を検出および定量する方法

专利摘要:
本発明は、固体基材の表面に固定された、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む少なくとも１つの分子を検出および任意に定量するための方法に関し、この方法は、着色剤を使用する可逆性の直接比色分析方法である。本発明はまた、この方法の種々の使用および方法中に使用される溶液に関する。
公开号:JP2011513741A
申请号:JP2010549154
申请日:2009-03-05
公开日:2011-04-28
发明作者:オディール ヴァンドナビール―トランブーズ，；ガエル クソ，；パスカル シャザルヌル，；イザベル デスヴィン，；ミシェル ドブリジェヴィック，；ポストレック，；オレリ ル
申请人:サントル ナシオナル デチュード スパシアル；
IPC主号:G01N33-68

专利说明:

[0001] 本発明は、少なくとも１つのプロトン化基を含む界面、例えばアミノおよび／またはタンパク質界面を有する基材の分野に関する。
より詳細には、本発明は、これらの基材の少なくとも１つのプロトン化基を含む界面、例えばアミノおよび／またはタンパク質界面を特性評価することができる方法および手段を提供することを対象とする。本発明に従う方法は、迅速で、実施が簡便であり、可逆性でもある。この可逆性により、本発明の方法を実施した後にその界面を使用できる。この方法は、優れた感度および優れた適用量の線形性を有し、界面に影響を与えないので、こうして被覆された基材を特性評価後に任意に使用できる。]
背景技術

[0002] 生物学に有用な試薬の分野、より詳細には細胞培養、診断、および生物学的分析の分野において、プロトン化基、例えばアルキルアミンまたはその他のアミノ基および特にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を表面に有する種々のタイプの基材が存在する。
特に、１つ（またはそれ以上）のタンパク質からなるマトリックスを表面に有する基材は、それらが細胞培養の接着、および任意にそれらの分化を促進するので、細胞培養の状況において特に有用な基材である。こうした基材はまた「コーティングされた基材」としても知られている。
ペプチドチップ、タンパク質チップ、坑体チップまたは細胞チップタイプの基材も、基礎研究および臨床研究の両方において広く使用されているツールである。特に、こうした基材は、免疫応答を評価するため、および特にエピトープに対して特異な抗体もしくは後者に付属するミモトープを探索するために使用される。分子相互作用の検出にもペプチド／タンパク質／抗体／細胞チップタイプの基材を使用する。
表面にアミノ基を有するこれらの基材の調製中または使用中において、アミン官能基のグラフト化、それらの均質性またはそれらの安定性を検証するために、そのグラフト化を検証することが必要である。]
[0003] 特許文献１は、固体基材上に固定された少なくとも１つのアミンを含む分子の相対平均量を決定するための方法を提供する。この方法は、（１）１つ（またはそれ以上）の発光標識および（２）１つ（またはそれ以上）のアミンを含有する既知量の分子が固定された固体基材を使用するものであり、この基材は参照として作用する。特許文献１の主題であるこの方法は、第１０欄２９〜３２行に示されるように一方では非可逆性であり、他方では標準の使用を必要とするので実施が面倒である。
当業者は、溶液中のタンパク質を定量するための種々の技術、例えばＬｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、Ｂｉｕｒｅｔ法などを認識している。
クマシーブルーは、溶液中にて迅速に、すなわち５分未満の時間で媒質のタンパク質濃度を見積もるためにＢｒａｄｆｏｒｄ法で使用される着色剤である。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により、溶液１ｍｌあたり１μｇオーダーのタンパク質を検出閾値として、溶液中のタンパク質をアッセイできる。ｐＨが１未満である溶液を用いるＢｒａｄｆｏｒｄ［非特許文献１］によって記載される条件下において、形成されたブルータンパク質複合体は、吸収ピークの、赤（λｍａｘ＝４７０ｎｍ、ｐＨ＜１）（遊離カチオン性形態）から緑（λｍａｘ＝６５０ｎｍ、ｐＨ約１）（中性形態）、次いで青（λｍａｘ＝５９５ｎｍ、２≦ｐＨ≦１１）（アニオン性結合形態）への移動をもたらす。クマシーブルーに関して、これまで文献ではめったに言及されなかった「ピンク−バイオレット」に着色した第４形態（λｍａｘ＝５３０ｎｍ、ｐＨ≧１１）が存在する。１９９３年からの唯一の参照文献を参照する［非特許文献２］。さらに、クマシーブルーの４つの遊離形態（λｍａｘ＝４７０、６５０、５９５または５３０）の１つを溶液中でアッセイすることはこれまで文献に報告されていない。]
[0004] 特許文献２には、膜または他の多孔性基材上にてゲルに存在するタンパク質を迅速に視覚化するためにクマシーブルーを用いる染色方法が記載されている。この染色方法は、１〜１００ｍＭ濃度に希釈された酸および０．０００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）濃度でのクマシーブルーを含有する溶液を使用する。しかし、特許文献２に記載される発明では、バンドあたりに存在するタンパク質の量の直接的な見積もりも、「染色された」タンパク質に存在するアミンの数の定量分析も不可能であり、着色剤を分離する可能性についても言及されていない。]
[0005] 米国特許第６，６９６，３０４号
米国特許第６，５５５，３８２号]
先行技術

[0006] Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６
Ｃｈｉａｌ，１９９３]
発明が解決しようとする課題

[0007] 固体（多孔質または非多孔質）基材にグラフトされた、例えばタンパク質、ペプチドまたは少なくとも１つのアミンを含むいずれかの分子に属するプロトン化部位の存在を明示および／または定量し、この基材を後で（すなわち明示および／または定量の後に）使用可能にする簡便で感度の高い（＜１μｇのタンパク質）可逆性の比色分析方法は存在しない。]
課題を解決するための手段

[0008] 本発明は、着色剤の直接アッセイに基づく新規な分析方策を提案することによって上記技術問題を解決できる。「直接アッセイ」という用語は、基材の表面に存在するアミンに対してこの比色分析剤を選択的に結合させ、次いで過剰の着色剤を除去した後に、特性評価されるべき基材から「脱グラフト化された」着色剤のアッセイを意味することを目的とする。本発明は、アミノ基材（粗または「コーティングされた」、すなわち界面で覆われた基材）の特性評価を対象とする。本発明の状況において、「特性評価」という用語は、固体支持体の表面に任意に存在するアミンの検出だけでなく、それらの定量、すなわちこの固体基材表面にある利用可能なアミンの数の決定を意味する。アミン官能基（ａｍｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の数は、基材の表面積あたりまたは質量単位あたりで表現される。]
[0009] 本発明は、コーティングされた基材、ペプチドチップ、タンパク質チップ、坑体チップまたは細胞チップの分野だけでなく、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を表面に有する固体基材を使用するあらゆる分野に適用されるという事実により、注目に値する。]
[0010] 本発明は、固体基材表面に固定されたアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む少なくとも１つの分子を検出および任意に定量するための方法に関し、この方法は、着色剤を使用する直接比色分析方法である。]
[0011] より詳細には、本発明は、固体基材表面に固定されたアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む少なくとも１つの分子を検出および任意に定量するための方法に関し、この方法は次の連続工程を含む：
ａ）固体基材表面に、着色剤を含有する溶液Ｔ１を接触させる工程、
ｂ）工程（ａ）中、上記表面と反応しなかった着色剤を除去する工程、
ｃ）着色剤とアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子とで形成された可能性のある複合体を解離できる溶液Ｔ２と、上記表面とを接触させる工程、
ｄ）アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子を検出および任意に定量するために、溶液Ｔ２中に存在する可能性のある着色剤を検出する工程。
本発明に従う方法の主要な工程は、着色剤としてクマシーブルーを用いて図１に図示される。] 図１
[0012] 本発明の状況において、「着色剤」という用語は、可視光範囲の吸収または発光の特性を有する化学化合物を意味する。拡大解釈すれば、「着色剤」という用語はまた、近紫外線から近赤外線の範囲に及ぶ広い範囲、すなわち一般に２８０〜３０００ｎｍの波長範囲において、吸収、発光または再発光特性を有する化合物を示すことができる。さらに、本発明の状況において使用できる着色剤は、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子と反応できるいずれかの着色剤、有利なことには有機着色剤からなる。]
[0013] 本発明に従う方法の状況において使用される着色剤は、特に、アントラキノン、モノおよびジクロロトリアジン、（ジ）アゾ誘導体およびトリフェニルメタンファミリーから選択される。これらのファミリーは、特に、ポンソーレッド（またはポンソーＳ）（ＣＡＳ Ｎｏ．６２２６−７９−５）、ポンソー２Ｒ（ＣＡＳ Ｎｏ．３７６１−５３−３）、ポンソー４Ｒ（ＣＡＳ Ｎｏ．２６１１−８２−７）、ポンソー６Ｒ（ＣＡＳ Ｎｏ．２７６６−７７−０）、アゾルビン（ＣＡＳ Ｎｏ．３５６７−６９−９）、プロシオンイエロー４Ｒ、プロシオンルビン（ＣＡＳ Ｎｏ．１７７５２−８５−１）、ブリリアントブルーＦＣＦ（ＣＡＳ Ｎｏ．３８４４−４５−９）、レマゾールブリリアントブルー（ＣＡＳ Ｎｏ．２５８０−７８−１）、ファストグリーンＦＣＦ（ＣＡＳ Ｎｏ．２３５３−４５−９）、アミドブラック（ＣＡＳ Ｎｏ．１０６４−４８−８）、プロシオンブルー（ＣＡＳ Ｎｏ．１２２３６−８２−７）、セルババイオレット（ＣＡＳ Ｎｏ．９１００１０−０３−９）、クマシーブルー（ＣＡＳ Ｎｏ．７８６４２−６４−５またはＣＡＳ Ｎｏ．６１０４−５８−１）およびこれらの混合物である。]
[0014] 本発明に従う方法の状況において使用される着色剤はまた、蛍光剤またはりん光剤から選択できる。これらの蛍光剤またはりん光剤は、少なくとも１つのスルホネート官能基および／または少なくとも１つのカルボキシレート官能基を有する蛍光剤またはりん光剤であるのが有利である。一例として、こうした蛍光剤またはりん光剤のうち、フルオレセインおよびこれらの誘導体、例えば６−カルボキシフルオレセイン（ＣＡＳ Ｎｏ．３３０１−７９−９）；エオシンＹ（ＣＡＳ Ｎｏ．１７３７２−８７−１）；エオシンＢ（ＣＡＳ Ｎｏ．５４８−２８−３）；ローダミンＢ（ＣＡＳ Ｎｏ．８１−８８−９）、スルホローダミン１０１（ＣＡＳ Ｎｏ．６０３１１−０２−６）、ピラニン（ＣＡＳ Ｎｏ．６３５８−６９−６）およびカルジオグリーン（Ｃａｓ Ｎｏ ３５９９−３２−４）などを挙げることができる。]
[0015] 本発明の状況において有利に使用される着色剤は、クマシーブルーである。この着色剤は、より詳細には、クマシーブルーＧ２５０、クマシーブルーＲ２５０、クマシーブルーＲ１５０およびクマシーブルーＲ３５０で構成される群から選択される。]
[0016] 有利なことには、本発明の状況において使用されるプロトン化基は、正の基本的な電荷を保持するいずれかの基であってもよい。より詳細にはこうした正の基本的な電荷は、窒素原子によって保持される。故にプロトン化基は、アミン官能基、イミン官能基、グアニジン官能基およびヘテロアリール基で構成される群から選択できる。]
[0017] 本発明の状況において「ヘテロアリール基」という用語は、ヘテロ芳香族炭素系構造を意味し、それは、任意にモノ置換またはポリ置換されており、１つ以上のヘテロ芳香族環で構成され、それぞれの環は３〜８個の原子を含み、この構造はヘテロ原子Ｎを有し、他の任意のヘテロ原子はＮ、Ｏ、ＰまたはＳであることができる。置換基は、１つ以上のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｐ、Ｓｉ、ＢｒまたはＳを含有してもよく、またアルキル基、特にＣ１−Ｃ６アルキル基を含有してもよい。]
[0018] 本発明の状況において使用できるアミン官能基は、−ＮＨ２タイプの一級アミン官能基、ＮＨＲタイプの二級アミン官能基（Ｒは炭素系基を表す）、またはＮＲ’Ｒタイプの三級アミン官能基（ＲおよびＲ’は同一または異なる炭素系基を表す、または（環状アミンの場合は）同じ炭素系基に属する）である。好ましくは、本発明の状況において使用されるアミン官能基は、−ＮＨ２タイプの一級アミン官能基またはＮＨＲタイプの二級アミン官能基（Ｒは炭素系基を表す）である。]
[0019] 本発明の状況において使用できるアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子は、当業者に既知のアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を有するいずれかの分子である。この分子は、特に、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、補欠分子族を有するタンパク質（例えばグリコタンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、金属タンパク質、色素タンパク質またはヘムタンパク質）、坑体、アミン基転移核酸、生体アミン、アルキルアミン、アミノポリマー、ＰＡＭＡＭ（ＰｏｌｙＡＭｉｄｏＡＭｉｎｅ；ポリアミドアミン）タイプまたはＰＰＩ（Ｐｏｌｙ（ＰｒｏｐｙｌｅｎｅＩｍｉｎｅ）；ポリ（プロピレンイミン））タイプのデンドリマー性構造または国際出願ＷＯ２００６／１１４５２８に記載されるデンドリマー性構造等のデンドロンおよびデンドリマー、これらのフラグメントならびにこれらの誘導体で構成される群から選択される。]
[0020] 本発明の状況において使用でき、コーティングされた表面の界面タンパク質（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）として既に使用されているタンパク質の例として、ストレプトアビジン、ゼラチン、コラーゲン（特にコラーゲンタイプ１）、フィブロネクチン、リゾチーム、直鎖状ポリリシン、ウシ血清アルブミンなどを挙げることができる。さらに、ポリアクリルアミドタイプのアミノポリマー、特に例えば式−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−のポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）（１０＜ｎ＜１０５）もコーティングされた表面の界面タンパク質として使用されている。]
[0021] 本発明は、上記で定義されたアミン官能基のようなプロトン化基を含有する分子の誘導体を用いることを想定する。「誘導体」という用語は、上記で定義される少なくとも１つのプロトン化基、例えばアミン官能基を含む分子との同一性が、特にこれらの分子のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％および／または９５％を示す分子を意味する。]
[0022] 少なくとも１つのプロトン化基、例えばアミン官能基を含む分子が、１つ（またはそれ以上）のアミノ酸を有する場合、この分子の誘導体は、少なくとも１つの追加アミノ酸、翻訳後修飾および／または化学修飾（特にグリコシル化、アミド化、アシル化、アセチル化、メチル化）、またはそれらの分解を防止できる保護基を有することができる。]
[0023] プロトン化基、例えばアミン官能基を含有し、１つ（またはそれ以上）のアミノ酸を有する分子の誘導体はまた、その１つ（またはそれ以上）のアミノ酸が、エナンチオマー、ジアステレオアイソマー、Ｄコンフォメーションの天然アミノ酸、βアミノ酸、置換されたαアミノ酸、希少アミノ酸、特にヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ピログルタミンおよびアミノ酪酸、および合成アミノ酸、特にオルニチン、ノルレウシン、ノルバリン、シクロヘキシルアラニンおよびωアミノ酸で構成される群から選択されるものであってもよい。]
[0024] アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子のフラグメントは、一例として、
−８個を超えるアミノ酸、特に１０個を超えるアミノ酸、またはさらに１５個を超えるアミノ酸を有するのが有利なペプチドフラグメント、
−少なくとも、従来の免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインおよび／または軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、あるいはさらに単鎖免疫グロブリンの可変ドメイン、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＶＨＨフラグメントを含む抗体フラグメント、
−５個を超えるヌクレオチド、特に１０個を超えるヌクレオチドまたはさらには１５個を超えるヌクレオチドを有するのが有利なアミノ基転移核酸のフラグメント
である。]
[0025] 上記で定義されたアミン官能基のようなプロトン化基を含有する分子、これらの誘導体およびこれらのフラグメントは、天然生成物、または当業者に周知の分子生物学および遺伝子工学技術に従って得られた組換え生成物であることができ、または同様に当業者に周知の固相もしくは液相合成のような技術に従って合成できる。]
[0026] 本発明の状況において、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む１つ（またはそれ以上）の分子を表面に固定できるいずれかの基材が、本発明の状況において使用できる。]
[0027] 本発明の１つの変形例において、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子が固定された固体基材または少なくとも固体基材の表面は、特に無機固体基材または表面である。特に、表面だけが特定の無機材料で構成され、基材の残りは別の無機材料で構成されるかまたは有機材料で構成される固体基材を想定できる。有利なことには、固体支持体または固体支持体の表面は、ガラス、石英、セラミック（例えば酸化物タイプ）、金属（例えば、アルミニウム、クロム、銅、亜鉛、銀、ニッケル、スズまたは金）、半金属（例えば、ケイ素または酸化ケイ素）およびこれらの混合物で構成される群から選択される無機材料で構成される。]
[0028] 本発明の別の変形例において、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子が固定された固体基材または少なくともその表面は、有機材料、例えばポリマー、例えばアガロース、またはナイロン、ポリエチレングリコール、ポリカーボネート、ポリフルオロポリマー、または複合体を含む樹脂で構成される。また、表面だけが特定の有機材料で構成され、基材の残りは別の有機材料または無機材料で構成されている固体基材を想定することもできる。]
[0029] 固体基材は、種々のサイズを有する種々の形態であることができる。一例として、それは、スライド、マイクロプレート、粒子、ゲル（例えばアガロースゲル）、ビーズ、ミクロビーズ、繊維、管（例えば溶血管）、またはキャピラリータイプのミクロチャンネルの形態であってもよい。これらの種々のタイプの基材は、数百マイクロメートルから数センチメートルまでに及ぶサイズを有することができる。]
[0030] 本発明の１つの特定実施形態において、固体基材は、表面保持官能基を有するため、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子を固定できる。有利なことには、これらの官能基は、カルボン酸基、ラジカル部分、アルコール官能基、アミン官能基、アミド官能基、エポキシ官能基またはチオール官能基から選択される。この官能化は、使用される固体基材の表面における材料の特性に固有であってもよい。有利なことには、この官能化は、少なくとも１つの溶媒、洗剤、放射線またはプラズマでその表面を洗浄することによって、あるいは上記で定義された官能基を形成するための他のいずれかの方法によって得ることができる。]
[0031] 本発明の第１の変形例において、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子は、任意に官能化された固体基材の表面に直接固定されることができる。タンパク質で「コーティングされた」固体基材は、直接固定の一例である。]
[0032] 本発明の第２の変形例において、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子は、任意に官能化された固体基材の表面に間接的に固定できる。この間接固定は、一方では固体基材と、他方ではアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子と結合したスペーサーアーム（または接合剤）を含む。スペーサーアームは、本発明に従う方法の工程（ａ）中に着色剤と反応してもよく、またはしなくてもよく、特に工程（ａ）中に反応できるアミン官能基のようなプロトン化基を有していてもよく、または有していなくてもよい。当業者は、こうしたスペーサーアームの種々の例を認識している。限られたものではあるが、本発明の状況において使用できるスペーサーアームとしては、１，６−ジアミノヘキサン、６−アミノヘキサン酸、スクシンイミド基、エポキシド、ＵＤＰ−グルクロン酸、１〜２０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖アルキル鎖、ポリエチレングリコール、グルタルアルデヒドなどを挙げることができる。]
[0033] 直接または間接固定中に使用される結合は、当業者に既知のいずれかの結合、特に共有結合、イオン性結合、水素結合、吸着などであってもよい。]
[0034] 「染色」工程と呼ばれる本発明に従う方法の第１の工程（工程ａ）は、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子を示すことができる表面を所定濃度の着色剤と接触させることで構成される。この着色剤は、溶液Ｔ１に希釈される。]
[0035] 溶液Ｔ１は、上記で定義されたような着色剤の１つを使用する染色中に普通に使用される溶液であり、特に溶液中でのアッセイ中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルの染色もしくはセルロース膜の染色中に使用される溶液である。故に、当業者は、使用される着色剤に依存して、いずれの溶液Ｔ１（成分の特性および量）を使用すべきかがわかる。]
[0036] 有利なことには、溶液Ｔ１は、アルコールおよび／または酸を含む水溶液である。溶液Ｔ１のｐＨは、有利なことには１より大きい、特に２より大きい。]
[0037] 溶液Ｔ１中に含有されるアルコールは、有利なことには、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、およびこれらの混合物で構成される群から選択される。アルコールの割合は、溶液Ｔ１の総体積に対して、１体積％〜２５体積％、とりわけ２体積％〜２０体積％、特に５体積％〜１５体積％である。]
[0038] 溶液Ｔ１に含有される酸は、有利なことには、酢酸、トリクロロ酢酸、リン酸、塩酸、硫酸、過塩素酸およびこれらの混合物で構成される群から選択される。酸の割合は、溶液Ｔ１の総体積に対して、０．５体積％〜２０体積％、とりわけ１体積％〜１５体積％、特に２体積％〜１０体積％である。]
[0039] 上記で定義された着色剤は、溶液Ｔ１の総体積に対して、０．００１質量％〜１質量％、とりわけ０．００５質量％〜０．５質量％、特に０．０１質量％〜０．１質量％の量で使用される。]
[0040] 本発明に従う方法の工程（ａ）は、有利なことには、周囲温度（すなわち、２０〜２５℃の温度）にて、撹拌しながら行う。本発明に従う工程（ａ）の期間は、３分を超える、とりわけ５分を超える、特に５分から２時間、より詳細には５分から１時間、最も詳細には５〜３０分である。]
[0041] 例として、着色剤がクマシーブルーである場合、溶液Ｔ１は、８５％のミリＱ水、１０％の分析品質のメタノール、および５％の分析品質の酢酸を含み、そのｐＨは２．２である。クマシーブルー（Ｇ−２５０）は、染色工程中この溶液にて０．０５質量％で使用される。]
[0042] 固体基材上に固定された、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子、特にアミンとクマシーブルーとの相互作用を最大にするために、着色剤は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試験による溶液中のアッセイ期間に使用される濃度よりもかなり高い濃度Ｃにて溶液Ｔ１中で使用されている。５００μｇ／ｍＬ以上のこの濃度Ｃは、直接計測の間に吸収シグナルが飽和となるので、溶液中でのアッセイができない。５００μｇ／ｍＬ濃度のクマシーブルーを使用することにより、溶液Ｔ１を再使用できる。さらに、高濃度のクマシーブルーを含有する溶液Ｔ１は、使用されるフォーマットに従う設定工程を回避できる；故に、本発明にて試験されるマイクロプレートフォーマットよりも高い結合能を有するフォーマットにて使用できる。]
[0043] この教示および当業者の知識に基づいて、後者は、上述の利点を得るために好適な、クマシーブルー以外の着色剤の量を選択できる。]
[0044] 本発明に従う方法の工程（ｂ）は、反応しなかった着色剤、特にアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子と複合体を形成しなかった着色剤を除去することを対象とする。この工程（ｂ）は、少なくとも１つの洗浄を含む工程で構成される。]
[0045] 有利なことには、本発明に従う方法の工程（ｂ）は、同一または異なる洗浄溶液による、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む１つ（またはそれ以上）の分子が固定された固体基材の表面の１回（またはそれ以上）の洗浄を含む。特に、本発明に従う方法の工程（ｂ）は、固体基材表面の少なくとも２回の洗浄、少なくとも３回の洗浄、少なくとも４回の洗浄または少なくとも５回の洗浄を含む。当業者は、方法の工程（ａ）中に使用される着色剤およびその濃度によっておよび使用される洗浄溶液によって洗浄の必要十分な数を規定する方法が容易にわかる。故に、当業者は、洗浄溶液を回収し、特に分光測定により、この溶液中の着色剤の存在を検証できる。洗浄溶液が着色剤を含有しなくなり次第、本発明に従う方法の工程（ｂ）を完了する。]
[0046] 洗浄は、同一または異なる洗浄溶液で行われてもよい。特に、工程（ｂ）中、各洗浄にて同一の洗浄溶液、一方の洗浄ともう一方の洗浄が異なる洗浄溶液、または一方の洗浄ともう一方の洗浄が同一または異なる洗浄溶液を用いることを想定できる。洗浄は、同一または異なる期間であることができ、これらの期間は数分（２、３、５、１０または１５分）から１時間（またはそれ以上）（１、２、３、４、５または１５時間）まで及ぶ。本発明に従う方法の工程（ｂ）は、有利なことには、撹拌しながら、周囲温度で行うだけでなく、周囲温度未満の温度、特により低温の室温（３〜６℃の温度）で行うこともできる。]
[0047] 当業者に既知のいずれかの洗浄溶液が、本発明に従う方法の工程（ｂ）の状況において使用できる。唯一の条件は、この洗浄溶液がアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の固体基材表面への固定と、工程（ａ）中に使用される着色剤とアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子とで形成される可能性のある複合体とに影響を及ぼさないことである。]
[0048] 一例として、方法の工程（ｂ）中に使用される洗浄溶液は、水、蒸留水、脱塩水、脱イオン水、リン酸塩緩衝食塩水（またはＰＢＳ）、食塩水溶液（例えばＮａＣｌ）、酢酸塩緩衝剤（例えばＡｃＯＮａ）、炭酸塩緩衝剤（例えばＮＨ４ＨＣＯ３またはＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３）、または上記で定義されたようなアルコールおよび／または酸を含む水溶液（すなわち、着色剤を含まない溶液Ｔ１）、およびこれらの混合物で構成される群から選択される。]
[0049] 有利なことには、本発明に従う方法の工程（ｂ）中の第１の洗浄は、この場合固体基材表面と接触した着色剤を含有する溶液Ｔ１の除去によって進行する。この除去は、特にタッピング、吸着、または取り出し（drawing-up）によって行うことができる。]
[0050] １つの特定実施形態において、最終洗浄は、水、特に蒸留水、脱塩水および／または脱イオン水（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社からのＭｉｌｌｉ−Ｑシステムにて精製された水、以降「ミリＱ水」と記載）を用いて行われる。]
[0051] 本発明に従う方法の工程（ｂ）の最終洗浄後、固体基材表面は、工程（ｃ）中の溶液Ｔ２と接触する前に乾燥できる。]
[0052] 本発明の方法の工程（ｂ）後の着色剤／プロトン化基、例えばアミン複合体の分光分析は、最終的なものではなかった。これは、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子と、着色剤、特にクマシーブルーとの複合体が、方法の検出閾値未満であったために分光光度計にて検出できなかったからである。溶液中において、Ｂｒａｄｆｏｒｄ条件下では、検出限界は、１μｇ／ｍＬの領域、すなわちマイクロプレートウェルについては０．１５μｇ／ウェルの領域であることを再び確認すべきである。しかし、分子量２１５００Ｄａを有するアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の界面の固体基材への固定後、本発明者らは、単純化したモデルに従って、ウェルの底にある単層は０．０２μｇを超えないことを計算した。そのため固体基材上の分子−クマシーブルーを直接計測することは、想定できない。]
[0053] 本発明に従う方法の工程（ｃ）は、用語「脱染色」工程と呼ばれ、基材の表面に存在する、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子と相互作用した着色剤を、溶液Ｔ２によって溶液に戻すことで構成される。この工程により、その特性評価後に基材の再使用を可能にすることによって、本発明の方法を「可逆性」にする。
故に、溶液Ｔ２は、着色剤と、基材の表面に存在するアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子との可能性のある複合体を解離できる溶液である。溶液Ｔ２の組成物は、染色工程（ａ）中に表面に結合したと考えられる着色剤すべてを分離するために最適化された。]
[0054] 着色剤と、少なくとも１つのアミン官能基を含む分子との複合体を解離する試みを、使用する基材をポリスチレンプレートとして、水、酢酸塩（ＡｃＯＮａ）、重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）および種々のモル濃度で１１．５までの範囲のｐＨでの重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３）緩衝剤、食塩水溶液（ＮａＣｌ（３Ｍ））、混合ＮａＣｌ／炭酸塩緩衝剤溶液、または５０％アルコールまでの範囲のアルコール性溶液（例えばメタノールまたはアセトニトリル（ＡＣＮ））のいずれかにより強い洗浄を用いて行った。ポリスチレン基材に適用されるこれらの試みは、成功せず、固体基材から着色剤を分離することはできなかった。]
[0055] ＡＣＮの存在下での混合物は、固体基材またはその表面に使用できる多くのポリマー材料（特にポリスチレン、多くのマイクロプレートの基本材料）のＡＣＮに対する化学耐性が低いため、排除された。]
[0056] 本発明者らは、Ｔ２と呼ばれる水／有機溶媒混合溶液により、着色剤とアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子との複合体を解離できることを明示した。有利なことには、即座に定量的に着色剤を分離できる溶液Ｔ２は、有機溶媒と、水酸化ナトリウム、苛性カリ（または水酸化カリウム）、および炭酸塩イオン、ならびにこれらの混合物から選択される構成要素とを含有する水溶液である。特に有利なことには、この溶液Ｔ２は、有機溶媒および炭酸塩イオンを含有する水溶液である。
溶液Ｔ２のｐＨは、有利なことには９を超える、とりわけ１０を超える、特に１１を超える、より詳細には１１．２５を超える。]
[0057] 当業者に既知の有機溶媒のいずれかを、本発明に使用される溶液Ｔ２に使用できる。当業者は、進歩性を必要とせずに、使用される基材、着色剤およびアミン官能基を保持する分子に応じて最も好適な有機溶媒を選択する方法がわかる。好ましくは、溶液Ｔ２に使用される有機溶媒はアルコールである。溶液Ｔ２に含有されるアルコールは、有利なことには、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールおよびこれらの混合物で構成される群から選択される。アルコールの割合は、溶液Ｔ２の総体積に対して、１０体積％〜８０体積％、とりわけ２５体積％〜７０体積％、特に４０体積％〜６０体積％である。]
[0058] 溶液Ｔ２は、有機溶媒に加えて、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、苛性カリ（ＫＯＨ）、炭酸塩イオン、またはこれらの混合物を含む。溶液Ｔ２に含有される炭酸塩イオン、水酸化イオン、カリウムイオンまたはナトリウムイオンは、０．００１〜１Ｍ、とりわけ０．００５〜０．５Ｍ、特に０．０１〜０．１Ｍのモル濃度を有する。本発明に従う方法に使用される溶液Ｔ２の炭酸塩イオンは、有利なことには、重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、重炭酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３）または炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）など、またはこれらの混合物の形態である。]
[0059] 本発明に従う方法の工程（ｃ）は、４〜５０℃、より有利なことには２０℃の温度にて、撹拌しながら行われる。本発明に従う工程（ｃ）の期間は、１秒を超えて５分未満である。
溶液Ｔ２の体積は、特性評価されるべき表面を完全に覆うような方法で選択されるべきである。しかし、工程（ｃ）中に導入されるべきこの体積は、着色剤の希釈が大きくなり過ぎず、工程（ｄ）中でのアッセイが可能となるように、大き過ぎてはいけない。大量の脱染色体積が必要であった場合には、有利なことには蒸発による濃縮工程が、工程（ｃ）の後、工程（ｄ）の前に想定できる。]
[0060] 本発明の方法の工程（ｄ）は、工程（ｃ）後に回収された溶液Ｔ２、すなわち上記で定義され、さらに方法の工程（ｃ）中にアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子と着色剤との複合体を解離して誘導された着色剤を含む溶液Ｔ２に存在する着色剤を検出することで構成される。]
[0061] 工程（ｄ）の前において、工程（ｃ）中に回収された着色剤も含む溶液Ｔ２は、有利なことには、酸性化または塩基性化に供することができる。この追加工程では、ｐＨ条件を着色剤の検出および任意に定量化の観点で最適にするために、工程（ｃ）中に回収された着色剤も含む溶液Ｔ２のｐＨを特に調整できる。]
[0062] 本発明に従う方法の工程（ｄ）中の着色剤の検出は、工程（ｃ）の後に得られた溶液Ｔ２の光学密度（または吸光度）を測定することで構成される。この溶液の光学密度は、使用される着色剤の吸収波長に前もって較正された分光光度計を用いて測定される。こうした検出は、使用される着色剤および溶液Ｔ２のｐＨに応じて、工程（ｄ）での検出が行われるべき吸収波長がわかる当業者にとっては慣用の作業である。]
[0063] さらに、同じ条件下、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の不存在下にて得られる光学密度を、本発明に従う方法の工程（ｄ）中で得られた光学密度から差し引くべきであることは明らかである。本発明の状況において、「同じ条件下」という表現は、同じ支持体、同じ工程（ａ）〜（ｄ）、すなわち同じ溶液Ｔ１およびＴ２、ならびに同一の使用される着色剤および量、同じ洗浄緩衝剤、各工程について同じ温度、期間および条件を意味することを目的とする。この差し引き後に得られた値は、「真の光学密度」または「真の吸光度」と呼ばれる。アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の不存在下で測定される光学密度は、測定の背景ノイズ、および着色剤と、固体基材、その任意官能基、任意スペーサーアームおよび／または本発明に従う検出および任意に定量方法を使用するためのアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子とは異なる、固体基材上に任意に固定されたアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子とで形成される可能性のある複合体を評価できる。]
[0064] アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む潜在的分子の存在下で本発明の方法に従う方法の工程（ｄ）中に得られた光学密度が、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の不存在下にて同じ条件にて得られた光学密度よりも大きいことから、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む少なくとも１つの分子が固体基材の表面に固定されていることを結論できる。]
[0065] 本発明に従う方法の工程（ｄ）中に得られる真の光学密度を基準にして、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の定量を、以降に示されるように、そして特に着色剤として使用されるクマシーブルーに関して、較正曲線を基準にして、または計算により行うことができる。
故に、本発明に従う方法の工程（ｄ）は、次で構成される以下のサブ工程を含んでいてもよい：]
[0066] ｉ）任意に予め酸性化または塩基性化された溶液Ｔ２中の着色剤の「真の吸光度」（または「真の光学密度」）を測定する工程；
ｉｉ）サブ工程（ｉ）にて測定された「真の吸光度」から、特に着色剤の吸光度についてその量および／またはその濃度の関数としての標準曲線に基づいて、溶液Ｔ２中に存在する着色剤の量および／または濃度を推定する工程；
ｉｉｉ）サブ工程（ｉｉ）にて得られた着色剤の量および／または濃度から、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基の量および／または濃度、ならびに／あるいはアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の量および／または濃度を推定する工程。
本発明に従う方法のサブ工程（ｉｉｉ）は、上記で定義されたようなプロトン化基および／または少なくとも１つのこうしたプロトン化基を含む分子と結合できる着色剤分子の数を予め決定して行うことができる。この先行する決定は、特に、以下の式（１）によって、プロトン化基を含む分子が着色剤の溶液に添加される場合に観測される吸光度（ΔＡ）における変化を規定するＢｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ法に基づく：
ΔＡ＝（ａＢｏｕｎｄ−ａＦｒｅｅ）ｌＤＢｏｕｎｄ （１）
式中：
−ａＢｏｕｎｄおよびａＦｒｅｅは、それぞれ、結合した着色剤および遊離の着色剤のモル消光係数である；
−ｌは、溶液が通過する光学経路の長さである（例として、実験が９６ウェルのマイクロプレートのウェルにて行われる場合に、ｌはウェル中の溶液の高さに対応し、３００μＬの溶液に関しては１．０５ｃｍのオーダーである）、および
−ＤＢｏｕｎｄは、結合した着色剤の濃度である。
より詳細には、この先行する決定は、次で構成される以下の工程の１つ以上を含んでいてもよい：
α）着色剤の種々の量または濃度を含有する溶液に関して得られる真の吸光度と、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ法とに基づいてモル消光係数ａＦｒｅｅを決定する工程；
β）少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の過剰量の存在下でモル消光係数ａＢｏｕｎｄを決定する工程；
この場合、すべての着色剤は、ＤＢｏｕｎｄが着色剤の初期濃度（ＤＴ）に等しくなるように、分子の部位に結合（ＤＢｏｕｎｄ）すべきであると考える。]
[0067] 故に、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔの式（１）は次の式（２）になる：
ΔＡ＝（ａＢｏｕｎｄ−ａＦｒｅｅ）ｌＤＢｏｕｎｄ＝（Δａ）ｌＤＴ （２）
式中、Δａは、モル消光係数の差であるａＢｏｕｎｄ−ａＦｒｅｅ。
Ａｔｈｅｒｔｏｎ数学モデルが、ａＢｏｕｎｄの決定中に使用される。Δａの値およびａＢｏｕｎｄの値は、選択された一定濃度の着色剤（ＤＴ）において少なくとも１つのプロトン化基を含む分子の逆数量または濃度（１／ΔＰＴ）の関数として吸光度における変化の逆数（１／ΔＡ）で表される二重逆数表示から得ることができる；
ε）過剰の着色剤の存在下、結合部位の総数（ｎＴｏｔａｌ）を決定する工程；
これは、過剰量の着色剤は結合の飽和に有利であり、最大数の結合部位が着色剤によって占有される、すなわちｎ＝ｎＴｏｔａｌであるからである。故に、ＤＴ＞＞ｎＴｏｔａｌＰＴ（ＰＴは、少なくとも１つのプロトン化基を含む分子のモル濃度を表す）は、ＤＢｏｕｎｄ＝ｎＴｏｔａｌＰＴを導き、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔの式（１）は以下の式（３）になる：
ΔＡ＝（Δａ）ｌｎＴｏｔａｌＰＴ （３）
故にｎＴｏｔａｌは、この曲線が直線である限り、過剰量の着色剤の存在下、ＰＴの関数としての曲線ΔＡから決定できる。故に、結合部位の理論的総数が別の独立した分析方法によって前もって決定されている場合、およびそういう場合にのみ、着色剤によって占有される部位の百分率は、少なくとも１つのプロトン化基を含む分子あたりで計算できる。]
[0068] 例として、使用される着色剤がクマシーブルーである場合、溶液Ｔ２は、分析品質のメタノール５０％、および有利なことには１１．２５以上のｐＨにて重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウムの形態である０．１Ｍの炭酸塩イオン溶液５０％で構成される溶液である。これらの条件下において、クマシーブルーは、これまで文献にはほとんど記載されていない、その「ピンク−バイオレット」に着色した第４の形態（λｍａｘ約５３０ｎｍ、ｐＨ≧１１）にて溶液に戻る。溶液Ｔ２において、遊離のクマシーブルーは、５２０ｎｍにて最大吸光度を有する。測定は、２０μＬのＨＣｌ（３Ｎ）を緩衝剤Ｔ２に添加した後で行われ、この場合ｐＨは６．１である。遊離形態のクマシーブルーは、青色に変わり、６１０ｎｍにて安定な最大吸光度を有する。酸性化緩衝剤Ｔ２におけるクマシーブルーの吸収スペクトルを所与とすると、最大吸光度は６１０〜６３０ｎｍの範囲であるため、吸光度測定は、その結果が実質的に影響を受けずに、この範囲に含まれるいずれかの波長にて行われることができ、較正範囲は同じ波長において実現されると考えられることに注目すべきである。この場合検出されるクマシーブルーの分子の数は、クマシーブルーとアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子とで形成される複合体が、より詳細にはクマシーブルーとアミン官能基のようなプロトン化基との間に形成されるので、特性評価されるべき表面にある利用可能なアミンのようなプロトン化基の密度と相関させることができる。]
[0069] 基材の表面に存在するアミンのようなプロトン化部位の数を定量することを目的として、本発明者らは、酸性化溶液Ｔ２のクマシーブルーの標準溶液を調製した（ｐＨ６．１、λｍａｘ＝６１０ｎｍ）。応答は、１５μｇ／ｍＬまで、特に０．５〜１５μｇ／ｍＬのクマシーブルーの濃度に関して直線である。この場合マイクロプレートウェルに関する定量限界は、３９．５ｎｇ／ｍＬである（変動係数（ＣＶ）＜２％；ｎ＝６４）。これは、ｃｍ２あたりに定量可能な１０１３クマシーブルー分子の最小量を表す。図２Ａに報告された値は、同じ日に行われた６回の測定の平均である。測定における標準偏差は、０．０２吸光度単位未満である。これらの範囲は、異なる日にｎ＝３の異なるハンドラーで数回繰り返された（中程度の忠実性、傾き＝０．０８０２、ＣＶ＜１％）。還元残基での試験（ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）では値が非常にランダムな分布を示すことを図２Ｂに報告する。] 図２Ａ 図２Ｂ
[0070] この手法の状況において、本発明者らは、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を有する分子あたり相互作用できるクマシーブルー分子の最大数を、この分子とクマシーブルーとで複合体を形成する間に規定しようとした。この目的は、プロトン化基、例えばアミンの数あたりのクマシーブルーの数の比を規定することである。]
[0071] Ｓｐｌｉｔｔｇｅｒｂｅｒ［Ｃｈｉａｌ，１９９３］［Ｃｏｎｇｄｏｎ，１９９３］の研究チームによれば、均質媒質において、タンパク質分子あたりに結合するクマシーブルーの分子の平均数は式（式３）によって与えられる。]
[0072] 本発明の場合、溶液Ｔ１において、クマシーブルー分子の数は、非常に大過剰である。固体基材のアミンのような表面プロトン化基と相互作用したクマシーブルー分子の総数を表すｎＴｏｔａｌの値は、本発明の脱染色工程中、すなわち溶液Ｔ２中の分離後のクマシーブルーのアッセイ中に決定される。故に、この値は、方法の工程（ａ）中に反応した基材のアミンのようなプロトン化基の数に直接比例する。]
[0073] Ａｔｈｅｒｔｏｎ［Ａｔｈｅｒｔｏｎ，１９９６］によって記載される２つのレベルのクマシーブルー濃度を有する数学モデルによれば、本発明者らは、飽和条件下において、クマシーブルーによって占有される部位の百分率は、ウシ血清アルブミンでは９３％であり、線状ポリ（リシン）では９３．５％であり、第２世代のリシンデンドリマーでは９１．７％、第３世代のデンドリマーでは９２．７％、第４世代のデンドリマーでは８９．９％、第５世代のＰＡＭＡＭタイプのデンドリマーでは９６．９％であった、すなわちＮＨ２のようなプロトン化基あたりのブルー分子は最大１つ存在する。]
[0074] 上記教示に基づいて、当業者は、進歩性を必要とせずに、クマシーブルー以外の着色剤、特にアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子と複合体を形成できる着色剤を用いて本発明を実施でき、この基は形成された複合体に直接関係しない。
本発明の分光測定の複数の変更適用例がある。]
[0075] 故に、本発明は、固体基材上のアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子を固定し、コーティングされた基材、ペプチドチップ、タンパク質チップ、抗体チップまたは細胞チップを生じることができる種々の方策（またはプロトコル）と比較するための、上記で定義されるような方法の使用に関する。]
[0076] 本発明はまた、コーティングされた基材、ペプチドチップ、タンパク質チップ、抗体チップまたは細胞チップが分析品質の基準をすべて満たすかどうかを検証するための、上記で定義されるような方法の使用に関する。これは、本発明によれば次によって表される分析品質基準のすべてを検証できるためである：]
[0077] −本発明の洗浄および／または染色／脱染色サイクルに関する、少なくとも１つのアミン官能基を含む１つ以上の分子を含む界面で覆われた基材の安定性、
−コーティングされた基材、ペプチドチップ、タンパク質チップ、抗体チップまたは細胞チップの製造における界面のグラフト化におけるロバスト性（繰り返し性および再現性）（実験内および実験間の均質性）、
−市販のコーティングされた基材、ペプチドチップ、タンパク質チップ、抗体チップまたは細胞チップなどとの比較による感度。]
[0078] 本発明はまた、対象とする液体中に存在する、アミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む分子、より詳細にはタンパク質、坑体またはこれらのフラグメントを検出および任意に定量するたための、上記で定義された方法の使用に関する。本発明の状況において、「対象とする液体」という用語は、細胞培養培地、またはヒトまたは動物の身体（血液、リンパ液、尿、唾液、精液などのタイプ）から単離または予め抽出された生体液を意味することを目的とする。この特定適用の実施は、次の連続工程を含む：]
[0079] −タンパク質に特異な少なくとも１つの抗原または少なくとも１つの抗体、探索しようとしている抗体またはこれらのフラグメントを表面に有する固体基材を調製する工程；
−こうして調製された基材と対象とする液体とを接触させる工程；
−上記で定義されるような本発明に従う方法の工程（ａ）；
−上記で定義されるような本発明に従う方法の工程（ｂ）；
−上記で定義されるような本発明に従う方法の工程（ｃ）；
−上記で定義されるような本発明に従う方法の工程（ｄ）。
工程（ｄ）の実施中、対象とする液体中に存在する少なくとも１つのタンパク質、少なくとも１つの抗体またはこれらのフラグメントの少なくとも１つを検出または定量する観点から、上記で定義されるような真の光学密度は、工程（ｄ）にて得られた光学密度から、タンパク質に特異な少なくとも１つの抗原または少なくとも１つの抗体、探索しようとしている抗体またはこれらのフラグメントを表面に有する固体基材に対して本発明に従う方法を実施した後に得られた光学密度を差し引くことによって得られることは明らかである。]
[0080] 本発明はまた、上記で定義されたような着色剤を、溶液Ｔ１の体積に対して０．０５質量％以上の量で含有する、上記で定義されたような溶液Ｔ１に関する。
本発明はまた、上記で定義されたような溶液Ｔ２、すなわちアルコールおよび炭酸塩イオンを含む溶液に関する。
本発明は、次を含有する、本発明に従う方法を行うためのアッセイキットのような構成要素のキットに関する：
−第１の区画において、上記で定義されるような溶液Ｔ１
−第２の区画において、上記で定義されるような溶液Ｔ２；
−および、任意に、上記で定義されるような１つ（またはそれ以上）の洗浄溶液。
有利なことには、本発明に従う構成要素のキットは：
−第１の区画において、上記で定義されるような溶液Ｔ１
−第２の区画において、上記で定義されるような溶液Ｔ２；
−第３の区画において、上記で定義されるような洗浄溶液；
−第４の区画において、溶液Ｔ２を酸性化するための溶液。]
[0081] 本発明の状況において、「区画」という用語は、瓶のような単一容器、または同じ溶液を含有する同一または異なっていてもよい１組の容器、例えばバイアル瓶を意味する。
本発明に従い、特に３２０回の測定を行うために使用できる構成要素のキットの特定例は：
−第１の区画において、酢酸／メタノール／超純水緩衝剤（ｖ：ｖ：ｖ；５：１０：８５）中の５００ｍｇ．ｍＬ−１でのクマシーブルー１００ｍｌ（試薬Ａ）；
−第２の区画において、メタノール中５０％にて、ｐＨ１１．２５での０．２５Ｍの炭酸塩緩衝剤１００ｍＬ（試薬Ｂ）；
−第３の区画において、酢酸／メタノール／超純水緩衝剤（ｖ：ｖ：ｖ；５：１０：８５）を含む洗浄溶液７５０ｍＬ（試薬Ｃ）；
−第４の区画において、塩酸（３Ｎ）１ｍｌの８個のバイアル瓶、
を含み、測定原理に従うべきプロトコルについての正確な指示リーフレット、およびキットまたは方法の使用中に問題が生じた場合のトラブルシューティングタイプのアドバイスを、このキットに添付できる。]
[0082] 最後に、本発明は、固体基材表面に固定されたアミン官能基のような少なくとも１つのプロトン化基を含む少なくとも１つの分子を直接検出および任意に定量するための、上記で定義されるような溶液Ｔ１、上記で定義されるような溶液Ｔ２、５２０ｎｍにて最大吸光度を有する「淡ピンク−バイオレット」形態のクマシーブルーおよび／または６１０ｎｍにて最大吸光度を有する「ターコイズブルー」形態のクマシーブルーの使用に関する。
本発明の他の特徴および利点は、非限定の例示によって与えられる、以降の実施例を読む際にさらに明らかになる。]
図面の簡単な説明

[0083] 本発明に従う方法の主要な工程の概略表示である。
溶液Ｔ２／ＨＣｌ中のクマシーブルーの直線範囲の決定（図２Ａ）および還元残基での試験（ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）（図２Ｂ）を示す。
溶液Ｔ２／ＨＣｌのｐＨの関数としての、６２０ｎｍにて測定される溶液Ｔ２／ＨＣｌ中のクマシーブルーに関する吸光度値を示す。
第２世代（Ｇ２）、第３世代（Ｇ３）、第４世代（Ｇ４）および第５世代（Ｇ５）リシン−グラフト化デンドリマー（国際出願ＷＯ２００６／１１４５２８）；ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー；天然タンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリゾチーム）；合成タンパク質（線状ポリリシン（ＰＬＬ））およびモノクローナル抗体（Ａｂ／ＰＢＳ）である、ポリスチレン固体基材に固定された種々の分子について、単一の染色／脱染色サイクル後（染色１）、または２つの染色／脱染色サイクル後（染色２）に測定された、溶液Ｔ２／ＨＣｌ中のクマシーブルーの真の吸光度を示す。] 図２Ａ 図２Ｂ
[0084] アルキルアミン（ＮＨ２）を示す市販の基材の特性評価
１．材料
フォーマット：９６−ウェルマイクロプレート；
材料：ポリスチレン；
コーティング：アルキルアミン（末端一級アミン）、Ａｍｉｎｅ（商標）Ｃｏｒｎｉｎｇ（＃２３８８）．
２．特性評価プロトコル
予備工程−調整：３００μＬの溶液Ｔ１（８５％のミリＱ水、１０％の分析品質のメタノール、５％の分析品質の酢酸）をウェル毎に導入する。この溶液は、周囲温度にて、１５分間、撹拌しながらウェルに接触させ続ける。
本発明の方法の工程（ａ）：溶液Ｔ１中の５００μｇ／ｍＬでのクマシーブルー（Ｇ２５０）１００μＬをウェル毎に導入する。この溶液は、暗所にて、周囲温度で１５分間撹拌しながらウェルに接触させ続ける。]
[0085] 本発明の方法の工程（ｂ）：ウェルを空にして、３００μＬのＴ１で３回洗浄し、次いで３００μＬのＴ１をウェル毎に添加する。この溶液は、周囲温度にて、１５分間撹拌しながらウェルに接触させ続ける。
本発明の方法の工程（ｃ）：ウェルを空にする。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）のネイティブマイクロプレート（Ｎｕｎｃ）を、ウェルあたり２０μＬの３Ｎ塩酸を用いて調製する。クマシーブルーと予め相互作用したプレートを、３００μＬの緩衝剤Ｔ２（５０％の０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤、ｐＨ１１．２５、５０％の分析品質のメタノールを含有する）で「脱染色」し、先に調製したＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに堆積するように、５分未満の時間で２７０μＬを除去する。
本発明に従う工程（ｄ）：次いで酸性化された回収溶液の吸光度を６２０ｎｍにて測定する。次の実施例において、真の吸光度を考える。真の吸光度は、計測された吸光度と、同じ条件下で得られた背景ノイズ（例えば、同じ緩衝剤溶液であるが、クマシーブルーを含まないなど）の吸光度との差の結果である。]
[0086] ３．結果]
[0087] 上記表１に与えられる結果は、本発明が、感度の高い繰り返し可能な様式で表面アミンの数を決定できることを示す。
特性評価の総時間は４８ウェルについて５５分であった；それは１つのウェルについて最小５０分である。このアッセイを行うために面倒な材料は必要でなく、４工程にて容易に行うことができる。故に本発明は、実施が簡便で、迅速で繰り返し可能である。]
[0088] 本発明によって記載される方法の線形性、定量限界（ＬＯＱ）およびロバスト性
１．線形性の試験
本発明に従う方法の線形性は既に議論した（図２を参照）。
２．ＬＯＱでの変動係数
ＬＯＱは、１６回の測定において、ブランクに対応する２９０μＬの溶液Ｔ２＋ＨＣｌ（実施例１で定義される）の体積を測定することによって、ＬＯＱ＝ＯＤｂｌａｎｋ＋１０＊σＯＤｂｌａｎｋとして見積もった。
このＬＯＱを見積もった後、４つのクマシーブルー溶液を、３つの異なるハンドラーにより市販のクマシーブルー（Ｇ−２５０）を用いて、溶液Ｔ２＋ＨＣｌ中ＬＯＱにて調製した。これらの４つの溶液は、６２０ｎｍにて１６回測定した（２９０μＬ／ウェル）。
結果
ＬＯＱは、３９．５ｎｇクマシーブルー／ｍＬであり、測定を行う前の蒸発により溶液を濃縮することによってこのＬＯＱを改善できる。
ＬＯＱにおける変動係数は、１．６４％である（ｎ＝６４、再現性）。] 図２
[0089] ３．Ｔ１におけるクマシーブルーの原料溶液の忠実性
Ｔ１におけるクマシーブルーの７つの原料溶液（５００μｇ／ｍＬ）を、１０日間にわたって４つの異なるハンドラーによって調製した。これらの７つの溶液のＯＤを、Ｔ１に１／５０で希釈した後に測定した（２７０μＬ、６２０ｎｍにて）。次いでこれらの溶液を、実施例１に記載されるＣｏｒｎｉｎｇからのアミン（商標）プレートの「染色」に使用した。
結果
Ｔ１におけるクマシーブルーの原料溶液のＯＤは、０．３９〜０．５吸光度単位である。
調製された２つの極度の溶液（ＯＤ０．３９およびＯＤ０．５）を用いてプレートを染色した結果、それぞれＯＤが０．１６８±＜２％および０．１６７±＜２％（両方の場合でｎ＝８）であった。これらの結果は、クマシーブルーの原料溶液の調製が再現可能な染色をもたらすことを示す。
４．緩衝剤Ｔ２＋ＨＣｌのｐＨの関数としての測定におけるロバスト性
０．１〜１１．２のｐＨに対応するＴ２におけるＨＣｌのモル濃度（１〜６Ｎ）およびＨＣｌの体積（５．４％〜１２％）の影響を試験した。
結果は、Ｔ２に添加された３ＮのＨＣｌ体積における５．７％の変動（±１．１μＬの３ＮのＨＣｌに対応する）は、測定されたＯＤに顕著な差をもたらさない（９８％でのスチューデント検定）ことを示す（図３）。] 図３
[0090] これらすべての結果は、本発明に記載される方法が感度が高く、真実であり、ロバスト性であることを示す。
５．Ｔ２＋ＨＣｌの共溶媒の関数としての測定におけるロバスト性
有機共溶媒（メタノール、エタノール）の影響を、アミン（アミン（商標）Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２３８８）でコーティングされたポリスチレン９６ウェルマイクロプレートにて試験したが、そこでは、実施例１に記載されるプロトコルに従う調整、染色および洗浄の後、実施例７に記載されるような緩衝剤Ｔ２を用いて、またはメタノールを同じ割合のエタノールで交換した緩衝剤Ｔ２を用いて脱染色した。
結果
６２０ｎｍにて測定された光学密度は：
−Ｔ２／メタノール：０．１５１±０．００８７（ｎ＝６）、
−Ｔ２／エタノール：０．１４７±０．００６４（ｎ＝６）。
エタノールおよびメタノールを用いて得られた結果は、統計学的に同一である（９５％でのスチューデント検定）。故に、メタノールをエタノールで交換できる。]
[0091] 異なるフォーマットおよび材料の基材における表面アミンの特性評価のための本発明の使用
１．ガラス溶血管（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ｔｕｂｅ）
フォーマット：溶血管
材料：ガラス
コーティング：これらの管は、Ａｒｋａｓら，２００５、Ｍｅｔｗａｌｌｉら，２００６およびＰａｔｈａｋら，２００４によって記載される方法に従って活性化された。活性化後、管は、Ａｒｋａｓら．２００５，Ｍｅｔｗａｌｌｉら．２００６およびＰａｔｈａｋら，２００４に記載されるプロトコルを用いて、第３世代のリシングラフト化デンドリマー（ＤＧＬ−Ｇ３）（国際出願ＷＯ２００６／１１４５２８）によりグラフト化した。グラフト化後、基材を上述のように洗浄する。ＤＧＬ−３のグラフト化は、次いで実施例１に記載される本発明のプロトコルに従って、３．５ｍＬ体積の染色（工程ａ）および脱染色（工程ｂ）を用いて特性評価された。
結果：ＯＤｒｅａｌ ０．０５６±０．０８（ｎ＝７）、すなわち３．５６×１０１４ＮＨ２／ｃｍ２。]
[0092] ２．ＣＯＣ、ポリスチレンおよびポリプロピレンマイクロプレート
フォーマット：２４または９６−ウェルマイクロプレート
材料：ＣＯＣ、ポリスチレンおよびポリプロピレン
コーティング：以下参照
−上記で記載されるように、エポキシドで表面官能化し、周囲温度にて１６時間、ＤＧＬ−Ｇ３（０．１Ｍの炭酸塩緩衝剤中２００μｇ／ｍＬ、ｐＨ９．５）をグラフト化し、次いで洗浄された、Ｇｒｅｉｎｅｒ（供給元により調整）からの２４−ウェルＣＯＣプレート；
−９６−ウェルのポリスチレン、Ｃｏｒｎｉｎｇ；実施例１を参照；
−アルゴンプラズマによる活性化に続いて、ジオキサン中のカップルＮ−アクリロイル−Ｎ−モルホリンおよびＮ−アクリロイル−Ｎ−スクシンイミド（ＮＡＭ／ＮＡＳ）の重合、水による洗浄および０．２ＭのＰＢＳ緩衝剤ｐＨ７．４にて１ｍｇ／ｍＬでのＤＧＬ−３によるグラフト化を行った、Ｇｒｅｉｎｅｒからの９６−ウェルのポリプロピレン（＃６５５２０１）。ＣＯＣについて記載されるような、過剰のＤＧＬ−Ｇ３の洗浄後の実施例１に記載されるプロトコルに従う特性評価。]
[0093] 結果：]
[0094] 表２に与えられる結果は、ＣＯＣ基材上のグラフト化の変動係数が、ポリプロピレンにて得られるものよりも非常に高いことを示す。これは、ポリプロピレンに使用される活性化−グラフト化方法がマイクロプレート全体にわたって均質である一方で、ＣＯＣプレートにおけるグラフト化は均質性に問題があることを明らかにする。故に、本発明に記載される方法は、表面でのグラフト化の均質性を試験することができる。
本発明に記載される方法は、一方のサイクルと他方のサイクルとが同一である染色結果をもたらす（表２）。故に、第１のサイクル（染色１）にて「染色され」、次いで第２の「染色」前に「脱染色される」アミンは、すべて遊離され、第１の測定と全く同一の結果を与えるような、２回目の「染色」が可能である（染色２）。これは、本発明が１／グラフト化の安定性を検証できるだけでなく、２／完全に可逆性でもあることを明示する。
最後に、表面積単位あたりのアミン官能基の密度（ＮＨ２／ｃｍ２）を評価する本発明は、互いに、異なる材料、フォーマットおよびグラフト化を有する基材を比較できる。
３．ポリプロピレンフェルトおよびディスク
フォーマット：５ｍｇのフェルトまたは直径６ｍｍのディスク
材料：ポリプロピレン
コーティング：ＤＧＬ−Ｇ３でグラフトした９６−ウェルのポリプロピレンマイクロプレートについて上述した活性化方法と同一。特性評価は、実施例１に記載のプロトコルに従って行う。]
[0095] 結果：]
[0096] 実施例３に与えられる結果はすべて、固体基材の表面アミンを検出および定量するための本発明に記載の方法が、上述したように、定量的であり、可逆性で、多くの材料、フォーマットおよびコーティングに関して好適であるこを示す。この記載された方法は、グラフト化の均質性および安定性を検証することができる。]
[0097] 固体基材上に吸着されたタンパク質のグラフト化における不安定性を特性評価するための本発明の使用
フォーマット：２４および９６−ウェルマイクロプレート
材料：ポリスチレン（ＧｒｅｉｎｅｒおよびＮｕｎｃ）
コーティング：
−Ｇｒｅｉｎｅｒ：「Ｃｅｌｌｃｏａｔｅｄ（著作権）ポリ−Ｌ−リシン」プロトコルに従って供給元により要求に応じて行われたＣｅｌｌｃｏａｔｅｄ（著作権）ポリ−Ｌ−リシン（ｒｅｆ ６５５９３０）９６−ウェルおよび２４−ウェルフォーマット；
−Ｎｕｎｃ：Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌポリ−Ｄ−リシンｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：１５２０３９。
結果：]
[0098] 表４における結果は、本特許に記載される方法が、グラフト化の不均一性（こうした吸着の場合）だけでなく、タンパク質が吸着され、支持体に共有グラフト化されていない場合のグラフト化の不安定性も明示できることを示す。]
[0099] グルタルアルデヒドを用いる間接グラフト化の再現性
ＤＧＬ（世代Ｇ３）デンドリマー界面の固定を、アミン（ＮＨＲ，Ｃｏｖａｌｉｎｋ（商標））で表面官能化された基材にてホモ二官能性リンク（グルタルアルデヒド）を介して行った。このプロトコルは、結合ヒスタミンに関して実験室で一般に使用されている［Ｃｌａｅｙｓ−Ｂｒｕｎｏ，２００６］。溶液の体積は、２００μＬ／ウェルである。得られた結果を以下の表４に示す。]
[0100] この作業では、まず、可能性としてのＤＧＬ凝集体および基材への非特異的な吸着を最大限除去するための最適な洗浄条件を設定できた。表５に示された値は、３回の炭酸塩緩衝剤／５０％ＭｅＯＨ洗浄浴後に得られる。同様に、これらのコーティングされた基材上での６回の染色／脱染色後に、Ｔ２中のクマシーブルーの値は、ウェル毎で変化せず、ブルー値は染色／脱染色サイクル後の同じウェルに関して９５％の閾値にて同一である。]
[0101] 第２に、本発明により、１００μｇ未満の濃度のＤＧＬ（Ｇ３）が、二官能性剤としてのグルタルアルデヒドを用いる方策の場合にコーティングされた基材の形成に十分であることが明らかになった。
しかし、本方策はまた、二官能性剤としてグルタルアルデヒドを用いるこうしたグラフト化方策に関して２つの異なる日にて行われたグラフト化、場合によっては一方のウェルと他のウェルとの間のグラフト化であっても、グラフト化で得られた値の観点からは大きな変動性があることも明示できた。故に、グルタルアルデヒドリンクを用いる固定方策が均質なグラフト化をもたらさないことを、こうした特定の場合に、検証できる。そのため、こうしてコーティングされた基材は、再現性の基準に合わない。
導入されたＤＧＬ濃度がいかなるものであっても、コーティングされた基材は、市販の基材の場合よりも３０倍高いクマシーブルー濃度をもたらす。さらに、基材への吸着によるＤＧＬのグラフト化は、炭酸塩緩衝剤／ＭｅＯＨ浴における洗浄後に、Ｔ２中で得られたブルー値が、ＮＨＲ基材にて得られたものとあまり変わらないことを示す。これは次のことを示唆している：
１／実際、非特異的な吸着は取り除かれている；
２／計測された値は、支持体に共有グラフトしたＤＧＬのみに関連している；
３／グルタルアルデヒドを介したＤＧＬ界面の固定方策では、それでもなお、脱染色工程後にウェルあたりのブルー分子がおよそ８×１０１４存在するので、以前の方策より、市販の基材に比較してもかなり高い表面アミン密度を得ることができる（感度の増大）。]
[0102] 固体基材上に固定された種々のタンパク質を特性評価するための本発明の使用（合成デンドリマー、合成および天然タンパク質、坑体）
フォーマット：９６−ウェルマイクロプレート
材料：ポリスチレン
コーティング：エポキシドで表面官能化されたプレート（Ｎｕｎｃ、固定剤ＮＨ２（商標））。タンパク質を、実施例９のポリプロピレンプレートに関して記載されたように、坑体を除いて、０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤ｐＨ９中、２００μｇ／ｍＬでグラフトし、それを０．２ＭのＰＢＳ緩衝剤ｐＨ７．４でグラフトする。]
[0103] 結果：図４は、記載された方法が、天然タンパク質および合成したものから誘導された表面アミンを、繰り返し可能な様式で等しく特性評価できることを示す。故に、この方法は、変動性の質量および起源（天然、合成）のタンパク質について、さらに合成アミン（実施例１参照）についても使用できる。] 図４
実施例

[0104] 参考文献
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Ｍｅｔｗａｌｌｉ Ｅ．， Ｈａｉｎｅｓ Ｄ． Ｂｅｃｋｅｒ Ｏ．， Ｃｏｎｚｏｎｅ Ｓ．， Ｐａｎｔａｎｏ Ｃ．Ｇ． （２００６） “Ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏ−， ｄｉ−， ａｎｄ ｔｒｉ−ａｍｉｎｏｓｉｌａｎｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｌａｓｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９８： ８２５−３１．
Ｐａｔｈａｋ Ｓ． Ｓｉｎｇｈ Ａ．Ｋ．， ＭｃＥｌｈａｎｏｎ Ｊ．Ｒ．， Ｄｅｎｔｉｎｇｅｒ Ｐ．Ｍ． （２００４） “Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ２０： ６０７５−７９．
２００４年２月２４日に公開された米国特許第６，６９６，３０４号（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
２００１年１１月２９日に公開された米国特許第６，５５５，３８２号（Ｗｏｎｄｒａｋ Ｅ．Ｍ．）。
２００６年１１月２日に公開された国際出願 ＷＯ ２００６／１１４５２８（ＣＮＲＳ ＆ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ ＩＩ）。]

权利要求:

請求項1
固体基材の表面に固定された少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む少なくとも１つの分子を検出および任意に定量するための方法であって、この方法が次の連続工程を含む、方法：ａ）固体基材表面に、２８０〜３０００ｎｍの波長範囲に吸収、発光または再発光の特性を有する着色剤を含有する溶液Ｔ１を接触させる工程；ｂ）工程（ａ）中に該表面と反応しなかった該着色剤を除去する工程；ｃ）該着色剤と該少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む分子とで形成された可能性のある複合体を解離できる溶液Ｔ２と、該表面とを接触させる工程であって、該溶液Ｔ２が、有機溶媒と、苛性カリおよび炭酸塩イオンならびにこれらの混合物から選択される構成要素とを含有する水溶液である、工程；ｄ）該少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む分子を検出および任意に定量するために、該溶液Ｔ２中に存在する可能性のある該着色剤を検出する工程。
請求項2
前記着色剤が、アントラキノン、モノおよびジクロロトリアジン、（ジ）アゾ誘導体およびトリフェニルメタンファミリーから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
請求項3
前記着色剤が、蛍光剤またはりん光剤から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
請求項4
前記少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、補欠分子族を有するタンパク質、坑体、アミン基転移核酸、生体アミン、デンドロンおよびデンドリマー、これらのフラグメントおよび誘導体で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
請求項5
前記少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む分子が固定された固体基材またはその固体基材の少なくとも表面が、無機の固体基材または表面であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
請求項6
前記少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む分子が固定された固体基材またはその固体基材の少なくとも表面が、有機材料で構成されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
請求項7
前記固体基材が官能基を保持する表面を有し、それによって少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む分子を固定できることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項8
前記少なくとも１つのプロトン化窒素基を含むこの分子が、固体基材の表面に間接的に固定されることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項9
前記溶液Ｔ１が、アルコールおよび／または酸を含む水溶液であり、該溶液Ｔ１のｐＨが１を超えることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項10
前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、およびこれらの混合物で構成される群から選択され、該アルコールの割合が、前記溶液Ｔ１の総体積に対して、１体積％〜２５体積％であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
請求項11
前記酸が、酢酸、トリクロロ酢酸およびこれらの混合物で構成される群から選択され、酸の割合が、前記溶液Ｔ１の総体積に対して、０．５体積％〜２０体積％であることを特徴とする、請求項９および１０のいずれか一項に記載の方法。
請求項12
前記着色剤が、前記溶液Ｔ１の総体積に対して、０．００１質量％〜１質量％の量で使用されることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項13
前記工程（ｂ）が、同一または異なる洗浄溶液による、固体基材表面の１回以上の洗浄を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項14
前記洗浄溶液が、水、蒸留水、脱塩水、脱イオン水、リン酸塩緩衝食塩水、食塩水溶液、酢酸塩緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、請求項８から１０のいずれか一項に記載されたアルコールおよび／または酸を含む水溶液、ならびにこれらの混合物で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
請求項15
前記溶液Ｔ２のｐＨが９を超えることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項16
前記溶液Ｔ２の有機溶媒がアルコールであることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項17
前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、およびこれらの混合物で構成される群から選択され、該アルコールの割合が、前記溶液Ｔ２の総体積に対して、１０体積％〜８０体積％であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
請求項18
前記溶液Ｔ２中の炭酸塩イオンが、０．００１〜１Ｍのモル濃度を有することを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項19
前記工程（ｄ）中の着色剤の検出が、前記工程（ｃ）の後に得られた溶液Ｔ２の光学密度を測定することで構成されることを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
請求項20
固体基材上の少なくとも１つのプロトン化窒素基を含む分子を固定し、コーティングされた基材、ペプチドチップ、タンパク質チップ、坑体チップまたは細胞チップを生じさせることができる種々の方策を比較するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法の使用。
請求項21
コーティングされた基材、ペプチドチップ、タンパク質チップ、坑体チップまたは細胞チップのロバスト性、安定性および感度を検証するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法の使用。
請求項22
対象とする液体中に存在する、少なくとも１つのタンパク質、少なくとも１つの抗体または少なくとも１つのこれらのフラグメントを検出および任意に定量するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法の使用。
請求項23
本発明に記載される方法を行うための構成要素のキットであって：−第１の区画において、請求項２および３のいずれか一項に記載される着色剤を、溶液Ｔ１の体積に対して０．０５質量％以上の量で含有する、請求項９から１１のいずれか一項に記載の溶液Ｔ１；−第２の区画において、請求項１および１５から１７のいずれか一項に記載の溶液Ｔ２；−および任意に、請求項１４に記載の１つ以上の洗浄溶液を含有する、キット。
請求項24
前記プロトン化窒素基が、−ＮＨ２タイプの一級アミン官能基、ＮＨＲタイプの二級アミン官能基（Ｒは炭素系基を表す）、またはＮＲ’Ｒタイプの三級アミン官能基（ＲおよびＲ’は同一または異なる炭素系基を表す、または同じ炭素系基に属する）、イミン官能基、グアニジノ官能基およびヘテロアリール基で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。