癌の診断および治療方法および組成物

专利摘要:
癌の発病を阻害し、癌の診断および治療のための方法および組成物が提供される。該治療法は、転写正因子４（ＰＣ４）のレベルまたは機能の阻害を含む。また、ＰＣ４の発現または機能の阻害に基づいて癌阻害剤をスクリーニングする方法が提供される。
公开号:JP2011510262A
申请号:JP2010523261
申请日:2008-09-05
公开日:2011-03-31
发明作者:グ、フイ
申请人:スージョウ アセントジーン シーオー．，エルティーディー．；
IPC主号:G01N33-68

专利说明:

[0001] （優先権主張）
本願は、２００７年９月７日に提出された米国仮特許出願番号６０／９７０，６８６の特典を主張する。]
[0002] 本発明は、癌の発病阻害、癌診断および治療の方法および組成物に関する。具体的には、本発明は、悪性組織中の転写正補因子４(transcriptional positive cofactor)（ＰＣ４）の発現および制御に関する。]
背景技術

[0003] ヒトの転写正補因子４（ＰＣ４）（ｐ１４、ｐ１５、Ｓｕｂｌ相同体等としても知られる）は、Ｎ−末端付近にセリンリッチ領域を備えた１２７アミノ酸残基の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。この補因子はクローニングされ、多くの配列特異的調節因子および細胞特異的調節因子と直接的に相互作用することにより多くの遺伝子の転写活性化を媒介する一般的な正補因子として同定されてきた[ゲ(Ge)およびレーダー(Roeder)、（１９９４）、クラスII遺伝子の転写活性化を媒介するヒトのコアクチベーターＰＣ４の精製、クローニングおよび特性評価(Purification, cloning and characterization of a human coactivator, PC4, that mediates transcriptional activation of class II genes)。Cell78、513-523；クレッツシュマー(Kretzschmar) Ｍ．ら（１９９４）、ウィルス性即時転写調節因子と相同性を有する新規なクラスＩＩ遺伝子転写の媒介物質(A novel mediator of class II gene transcription with homology to viral immediate-early transcriptional regulators)。Cell78、525-534]。ＰＣ４によって媒介される調節因子は多数の核ホルモンレセプタ、腫瘍抑制遺伝子、癌タンパク質、ならびにその他、腫瘍形成およびその他のヒトの病気の病因にとって極めて重要な因子を含む。]
[0004] ＰＣ４の発現は腫瘍抑制タンパク質ｐ５３によって制御されている。ｐ５３は、転写レベルでＰＣ４タンパク質自体と相互作用する。加えて、ＰＣ４は、細胞周期、アポトーシス、ＤＮＡ修復、およびその他の細胞反応に関与する多数の遺伝子の転写を制御するｐ５３の唯一のアクチベーターとして機能する[キショア(Kishore) A.H.ら、（２００７）、ｐ５３は、自身のアクチベーター−転写コアクチベーターＰＣ４を制御している(p53 regulates its own activator-transcriptional coactivator PC4: a new p53 responsive gene)。新ｐ５３応答性遺伝子(a new p53 responsive gene)。Biochem.J. BJ20070390；バナージー(Banerjee), Ｓら（２００４）、一般的な転写コアクチベーターＰＣ４はｐ５３の機能を活性化する(General transcriptional coactivator PC4 activates p53 function)。Mol.Cell Bio. 24, 2052-2062]。ＰＣ４活性は、少なくともリン酸化およびアセチル化を含む翻訳後修飾によってさらに制御可能である。ＰＣ４のリン酸化は、ターゲティングされたアクチベーターと相互作用するという自身の活性を阻害し、自身のコアクチベーター機能を負の方向に制御する。質量分析法により、ＰＣ４のインビボの過剰リン酸化が主としてカゼインキナーゼＩＩによって媒介されＮ−末端セリンリッチ領域に限定されることが示唆されている[ゲ(Ge), Hら、（１９９４）、リン酸化がコアクチベーターＰＣ４の機能を負の方向に制御する(Phosphorylation negatively regulates the function of coactivator)。Proc.Natl, Acad.Sci. USA91, 12691-12695]。ＰＣ４のアセチル化はｐ３００によって媒介されリン酸化によって阻害される[クモール(Kumor), P.B.R.ら、（２００１）、ヒト転写コアクチベーターＰＣ４のｐ３００−媒介アセチル化はリン酸化により阻害される(p300-mediated acetylation of human transcriptional coactivator PC4 is inhibited by phosphorylation)。J.Biol. Chem. 276, 16804-16809]。]
[0005] 癌または腫瘍形成に関する調節遺伝子におけるＰＣ４の役割は、これまでのところ明らかにされていない。高度な悪性腫瘍分子診断法が求められている。加えて、高度な腫瘍特異性を備え、かつ正常な細胞および組織に対する毒性が低い安全で効果的な癌阻害剤のみならず、癌阻害剤に関する高度なスクリーニング方法が求められている。]
課題を解決するための手段

[0006] したがって、本発明の目的の１つは、対象者から適切なサンプルを採集しＰＣ４タンパク質のレベルを測定することにより対象者の腫瘍を診断する方法を提供することである。本発明の一実施態様では、テストサンプル中のＰＣ４レベルがコントロールサンプルと比べて高いことが同定されれば、そのテストサンプルが腫瘍状であることが示される。別の実施態様では、テストサンプル中のＰＣ４のレベルが高ければ、悪性腫瘍であることが示される。本発明の別の実施態様では、対象者の腫瘍を診断する方法は、そのテストサンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルを測定することと、そのレベルをコントロールサンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルと比較することを追加的に含む。したがって、テストサンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルがコントロールサンプルと比べて高ければ、そのテストサンプルが腫瘍状であることが示される。]
[0007] 本発明の別の目的は、対象者の腫瘍を診断するための方法を提供することであり、その方法は、テストサンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルを測定し、そのレベルを、コントロールサンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルと比較することを含む。したがって、テストサンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルがコントロールサンプル中のものと比較して高ければ、そのテストサンプルが腫瘍状であることが示される。]
[0008] 本発明のさらに別の目的は、対象者のＰＣ４の細胞レベルを低下させるかＰＣ４の機能を阻害することによって癌を治療する、または対象者の癌の発病を阻害する方法を提供することである。本発明の一実施態様では、ＰＣ４タンパク質に対し有効量のアンタゴニストを含む製薬組成物を対象者に投与する。所定の実施態様では、ＰＣ４タンパク質に対するアンタゴニストは抗ＰＣ４抗体、ＰＣ４コーディング配列に基づくアンチセンス核酸分子、ＰＣ４遺伝子配列に基づくｓｉＲＮＡ分子、あるいは修飾された非機能性ＰＣ４ペプチドである。一実施態様では、その修飾された非機能性ＰＣ４ペプチドはＦ７７Ｐ点突然変異を含む。別の実施態様では、修飾された非機能性ＰＣ４ペプチドはリン酸化ＰＣ４タンパク質またはそれらの適切なフラグメントもしくは類似体を含む。]
[0009] 本発明のさらに別の目的は、癌阻害剤に関するスクリーニング方法を提供することである。本発明の一実施態様では、その方法は（１）適切なレポータ遺伝子に有効に(operatively)結合したＰＣ４遺伝子のプロモータ配列を含む遺伝子構造物を提供し、（２）レポータ遺伝子の発現に適した条件下でその遺伝子構造物と候補化合物を接触させ、レポータ遺伝子の発現を阻害する候補化合物が癌阻害剤であるとすることにより達成される。本発明の別の実施態様では、その方法は（１）ＰＣ４依存型転写分析試料を提供し、（２）その分析試料に候補化合物を添加し、ＰＣ４転写を減少させる候補化合物が癌阻害剤であるとすることによって達成される。本発明のさらに別の実施態様では、その方法は、（１）ＰＣ４−タンパク質相互作用分析試料またはＰＣ４−ＤＮＡ相互作用分析試料を提供し、（２）その分析試料に候補化合物を添加し、ＰＣ４−タンパク質相互作用またはＰＣ４−ＤＮＡ相互作用を減少させる候補化合物が癌阻害剤であるとすることにより達成される。]
[0010] 本発明のさらなる目的は、対象者の癌治療をモニタリングすることである。本発明の一実施態様では、その方法は、治療過程で複数回にわたりサンプルを採集し、そのサンプル中の転写正補因子４（ＰＣ４）タンパク質のレベルを測定し、治療過程でのサンプル中の転写補因子４（ＰＣ４）タンパク質のレベルを比較して、サンプル中の転写正補因子４（ＰＣ４）のレベルが低下すれば癌治療の成功とみなすことにより達成される。本発明の他の実施態様では、それらのサンプルはＤＮＡトポイソメラーゼＩタンパク質の発現に関して同時にまたは別個に検査され、それらのレベルが治療時間の経過に従って低下すれば、癌治療が成功している証拠となる。]
[0011] 本発明のさらなる目的は、ＰＣ−４依存型腫瘍治療用の治療薬剤としての突然変異型ＰＣ４タンパク質の使用法を提供することである。]
[0012] 本発明のさらに別の目的は、ＰＣ４の活性化ドメインに対応する短いペプチドの、癌阻害剤としての使用法を提供することである。]
[0013] 本発明のさらに別の目的は、人為的(artificial)活性化ドメインの癌阻害剤としての使用法を提供することである。]
[0014] 本発明のさらに別の目的は、ＰＣ４タンパク質に関連する試薬の腫瘍細胞への進入を容易にするための転移ドメイン（ＴＬＤ）の使用法を提供することである。]
[0015] 本発明のさらに別の目的は、ＰＣ４活性を阻害する化合物をスクリーニングするためのハイスループットシステム（ＨＴＳ）を提供することである。]
[0016] 本発明のさらに別の目的は、癌の治療法または癌の発病を阻害する方法を提供することであり、対象者に対し１種以上の癌阻害剤を投与することをさらに含む。]
[0017] 上記およびその他の目的が、本発明において達成される。]
[0018] 本発明は、転写補因子ＰＣ４の発現を計測する方法およびＰＣ４の機能の発現を減少させる方法を提供することにより、癌発病の阻害、癌の診断および癌治療の分野における主要な制限を克服する。]
[0019] よって、本発明のより重要な特徴については、比較的一般的な観点からこれまで概説してきた。その目的は、以下に続くその詳細がよりよく理解されるということと、本発明の当該技術分野における貢献がよりよく評価されるということである。無論、本発明の追加的な特徴については、以下にさらに記載されることになる。いずれにせよ、これまで述べてきた一般的な記述も以後の詳細な記述も典型的かつ説明的であり、請求されている発明をさらに説明することを意図したものであることは理解されねばならない。]
[0020] この点に関して、本発明の少なくとも１つの実施態様について詳細に説明する前に、本発明が、以下の明細書や図面で詳細に述べられている構造体の詳細および構成要素の配置に限定されるものではないということが理解されねばならない。本発明は他の実施態様にも適用可能であり、様々な方法で実施および実行可能である。また、ここで採用されている語法および用語は説明目的であって、限定を意図したものとみなすべきではないということが理解されねばならない。]
[0021] よって、当業者にとっては、本発明の幾つかの目的を実施する目的で、本開示内容の根拠となる概念が他の構造体、方法、およびシステムの基礎を成すものとして容易に利用され得ることが理解可能であろう。したがって、本発明の意図および請求範囲を逸脱しない限り、同等の構造体も本発明に含まれるということが重要である。]
[0022] 添付の図面は、本発明がより理解されやすいように提供されるものであり、本明細書に挿入され本明細書の一部を構成するものであって、本発明の幾つかの実施態様を例示し、明細書の記載と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。]
図面の簡単な説明

[0023] 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトＰＣ４の配列情報を提供する。図１Ａは、ヒトＰＣ４のｃＤＮＡ配列とプロモータ領域を示す（ジェンバンクアソシエーション(GenBankAccession)Ｎｏ．ＮＭ＿００６７１３）。
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトＰＣ４の配列情報を提供する。図１Ｂは、ヒトＰＣ４のコーディング領域を示す。
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ヒトＰＣ４の配列情報を提供する。図１Ｃは、ヒトＰＣ４のアミノ酸配列を示す。アミノ酸位置７７での点突然変異（Ｆ：フェニルアラニン；下線）は、ＰＣ４ｓｓＤＮＡ結合活性を消失させる。
図２は、ＰＣ４のＮ−末端での突然変異の解析を表しており、塩基性領域およびＦ７７を含む。
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、異なる分析試料におけるＰＣ４突然変異の機能的解析を示す。図３Ａは、様々な精製組換えＰＣ４タンパク質（野生型ＷＴおよび突然変異種ｍｔ）の標準化を示す。図３Ｂは、ＰＣ４のｄｓＤＮＡ結合活性に関する電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）の結果を示す。図３Ｃは、ＰＣ４によるインビトロの転写分析の結果を示すものであり、ｐＧ５ＨＭがＰＣ４依存型転写用鋳型で、ｐＭＬD５３がＰＣ４独立型鋳型である。
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅおよび４Ｆは、様々なＰＣ４突然変異種のタンパク質アレイ解析の結果を図示するものである。図４Ｃは、ＰＣ４および突然変異種と転写因子ＴＦＩＩＡとの相互作用を示す。図４Ｅは、ＰＣ４および突然変異種と転写因子Ｓｐ１との相互作用を示す。図４Ｆは、ＰＣ４および突然変異種とｓｓＤＮＡとの相互作用を示す。図４Ａと４Ｂは、サンプルのローディング量が等しいことを示しており、図４ＤはＧａｌ４への非特異的結合に関するコントロールである。
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ＰＣ４活性とアフリカツメガエル（Xenopus laevis）の変態との相関関係を図示しており、それによると、ＰＣ４はステージ５６〜５８の間に著しく活性化される。ゲルの個々のレーンは、オタマジャクシの発生の様々なステージを表す。図５Ａと５Ｂは、それぞれステージ２〜５８と５６〜６４を検査する別々の実験を表す。「Ｏ」は卵母細胞を表し、「Ｅ」は胚を表し、ＰＣ４−ＰはＰＣ４のリン酸化（非活性）形態を表す。図５Ｃは、ＰＣ４活性化とアフリカツメガエルの分化との相関関係を示す。甲状腺ホルモンＴ３とＴ４、甲状腺ホルモンレセプタＴＲαとＴＲβ、およびＰＣ４の効果についてのデータが示されている。
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、ＰＣ４が細胞核に局在され、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされたときに染色体凝縮およびアポトーシスを引き起こすことを示す。図６Ａは、コントロール（非トランスフェクト細胞）である。図６Ｂは、野生型ＰＣ４でトランスフェクトされた細胞を表す。図６Ｃは、ＰＣ４のセリンリッチ領域突然変異種でトランスフェクトされた細胞を表す。
図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、ＰＣ４ｍＲＮＡが形質転換細胞系および乳癌細胞系においては検出可能であるが、初代ＮＩＨ３Ｔ３細胞系および非悪性マウス組織ではそうではないことを示す。図７Ａは、ＲＮＡサンプルの定量化および同等のローディング量を表す。図７Ｂは、様々な細胞系における別の転写コアクチベーターであるｐ５２ｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｃは、様々な細胞系におけるＰＣ４ｍＲＮＡの発現を示す。
図８Ａと８Ｂは、ＰＣ４のウエスタンブロット解析とトポイソメラーゼＩのウエスタンブロット解析の結果を図示するものである。図８Ｂは、ＰＣ４タンパク質が多数のヒト腫瘍組織（Ｔ）において検出可能であるが、対応する正常な（Ｎ）ヒト組織では検出されないことを示す。図８Ａより、ＰＣ４の活性化が、各種癌阻害薬について十分に研究されてきた標的であるＤＮＡトポイソメラーゼＩの活性化と相関関係があることが分かる。
図９Ａと９Ｂは、ヒトの肺癌腫におけるＰＣ４の免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を表す。図９Ａは、ＰＣ４タンパク質が正常なヒトの肺組織においては検出不可能であることを示す。図９Ｂは、ＰＣ４タンパク質が、ヒトの肺癌腫組織の全ての腫瘍細胞に蓄積していることを示す。
図１０は、ＰＣ４の多種多様な機能を図示するものである。これらの機能は全て、癌の病因に関連しているかもしくはその原因となっているため、癌阻害剤の標的として適している。
図１１は、癌阻害剤として使用される可能性のある指定ペプチドのアミノ酸配列を提示するものである。] 図１０ 図１１ 図１Ａ 図１Ｂ 図１Ｃ 図２ 図３Ａ 図３Ｂ 図３Ｃ 図４Ａ
実施例

[0024] 本発明の実施態様について以下に詳細に言及する。それらの例は、添付の図面に図示されている。]
[0025] 発明者らは、アフリカツメガエル、哺乳動物細胞系およびヒト組織を含む様々な系を用いて、ＰＣ４が癌タンパク質として機能し、細胞分化、発生および腫瘍の病因で重要な役割を果たすという驚くようなことを発見した。具体的に述べるなら、肺癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、子宮体癌、甲状腺癌、および小腸癌を含む数多くの腫瘍組織において、ＰＣ４がタンパク質レベルで活性化されることが分かった。対照的に、対応する正常な組織（それ程急激な発生を経験していない）でのＰＣ４タンパク質レベルは活性化されていない。ｍＲＮＡレベルでのＰＣ４の活性化は、腫瘍細胞系および他の形質転換細胞系で発見されているが、初代細胞系では発見されていない。]
[0026] 腫瘍組織におけるＰＣ４の活性化はさらに、ＤＮＡトポイソメラーゼＩと相関関係にある。ＤＮＡトポイソメラーゼＩは、ＤＮＡを弛緩させる酵素であり、ＮＢ−５０６、Ｊ−１０９，３８２、ＤＢ−６７といった各種抗癌剤の標的である[ピルシュ(Pilch), B.ら、（２００１）、セリンリッチおよびアルギニンリッチスプライシング因子リン酸化の特異的阻害、スプライソソームアセンブリー、および抗腫瘍薬ＮＢ−５０６によるスプライシング(Specific inhibition of serine- and arginine-rich splicing factors phosphorylation, spliceosome assembly, and splicing by the antitumor drug NB-506)。Cancer Res.61, 6876-6884；チェン(Chen), A.Y.ら、（２００５）シラテカンＤＢ−６７は新規のＤＮＡトポイソメラーゼＩ−ターゲッティング放射線感作物質である(Silatecan DB-67 is a novel DNA topoisomerase I-targeted radiation sensitizer)。Mol. Cancer Thera. 4, 317-324]。]
[0027] ＤＮＡトポイソメラーゼＩのみならずｃ−ｍｙｃ、ｐ５３といった多くの癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子によってエンコーディングされるタンパク質が転写調節因子として機能することも知られており、それらの活性をＰＣ４により高めることも可能である。]
[0028] 上記のデータは、ＰＣ４が転写コアクチベーターとしての機能に加えて、細胞発生、分化、悪性形質転換、および癌の進行を刺激する癌タンパク質としても機能するという結論と一致する。実際、癌の病因におけるＰＣ４の活性化は、ＤＮＡアレイ法を用いた他の研究によって、ＲＮＡレベルで発見されている[ダス(Das), C.ら、（２００６）クロマチン−結合性タンパク質(chromatin-associated protein)である転写コアクチベーターＰＣ４がクロマチン凝縮を誘起する(Transcripional coactivator PC4, a chromatin- associated protein, induces chromatin condensation)。Mol.Cell.Biol. 26 8303-8315][クレイヴィ(Kleivi), K.ら、（２００７）、一次結腸直腸癌腫、肝臓転移、および癌腫症の遺伝子発現プロフィール(Gene expression profiles of primary colorectal carcinomas, liver metastases, and carcinomatoses)。Mol.Cancer.6, 1-16]。]
[0029] 本発明は、様々なタイプのヒト腫瘍の腫瘍形成に重要な役割を果たすＰＣ４が癌タンパク質であるという立証(establishment)に基づき、所定の実施態様において、対象者の腫瘍を診断する方法を提供するものであって、その方法は、対象者から適切な組織サンプルまたは液状サンプルが提供され、その中のバイオマーカとしてのＰＣ４タンパク質のレベルを検出することを含む方法であって、コントロールサンプルと比べてＰＣ４のレベルが高ければその検体が腫瘍状であることが示される。この方法がさらに、追加の証拠としてＤＮＡトポイソメラーゼＩといった他の関連するバイオマーカのレベルの検出を含んでいてもよい。]
[0030] 本発明はさらに、対象者の腫瘍の存在を検出する方法を提供するものであり、その方法は、対象者から適切なサンプルが提供され、その中のバイオマーカとしてのＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルを検出するということを含む。その場合、コントロールサンプルと比べてＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルが高ければ、その検体が腫瘍状であることが示される。]
[0031] さらに、本発明は細胞ＰＣ４レベルを低下させるか、またはその機能を阻害することによって癌を治療する方法および組成物を提供する。所定の実施態様では、本発明は癌の治療法を提供する。その方法は、有効量の適切なＰＣ４アンタゴニストを含む調剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む。具体的な実施態様では、その治療法は、肺癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、子宮体癌、甲状腺癌、小腸癌、卵巣癌およびその他の悪性腫瘍の治療に用いられる。]
[0032] 所定の実施態様では、適切なＰＣ４アンタゴニストを含むその調剤組成物を、ヒト腫瘍の病因を阻害するために予防目的で用いてもよい。]
[0033] 所定の実施態様では、本発明による適切な治療法または組成物は、修飾されたＰＣ４ペプチドに基づくものであってもよい。ＤＮＡに結合すると同時に他のタンパク質と相互作用する能力を持つことから証明されるように、ＰＣ４が多機能タンパク質であることは周知である。修飾された非機能性ＰＣ４突然変異体またはそのフラグメントが、細胞中の既存の野生型または非修飾ＰＣ４タンパク質に対し負に優性であり得ることが認識されている。あるいは、その修飾された非機能性突然変異体、その類似体またはフラグメントが、野生型または非修飾タンパク質と競合することによって、天然タンパク質の機能を効果的に低下させ得る。例えば、Ｆ７７Ｐ点突然変異種またはその同等物を含むＰＣ４タンパク質またはペプチド（ＰＣ４のＤＮＡ結合活性を消失させることが知られている）を調剤目的で使用することができる。類似の機能を有するペプチド模倣薬化合物は、動物の免疫系またはタンパク質代謝機構による破壊を回避することができるため、非常に望ましい薬剤となり得る。また、リン酸化ＰＣ４は不活性であるため、非リン酸化ＰＣ４（活性形態）と競合することにより、治療目的で使用できる。]
[0034] 本発明の適切なアンタゴニストは、抗体、アンチセンス核酸分子、および低分子干渉ＲＮＡ分子を含む。]
[0035] （抗体）
一実施態様では、本発明は、ＰＣ４タンパク質またはＤＮＡトポイソメラーゼＩ（「標的タンパク質」）の生物作用を阻害するための中和抗体を提供する。本発明に適した抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。その抗体がモノクローナル抗体であるのが好ましい。またその抗体がアイソフォーム特異性であってもよい。本発明のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、またはＦｖフラグメントであってもよい。ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（ホルト(Holt)ら、２００３、バイオテクノロジーのトレンド(Trendsin Biotechnology) 21:484-490参照）も、本発明の方法に適している。]
[0036] 公知の抗原で抗体を製造する様々な方法が、当業者間で公知である（例えば、ハーローとレーン(Harlow and Lane)、１９８８、抗体(Antibodies)： A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照；また、WO 01/25437を参照）。特に、適切な抗体は、細胞内免疫処理（すなわち、イントラボディ・テクノロジー(intrabody technology)）による化学合成、または、好ましくは組換え発現技術によって製造してもよい。抗体製造方法がさらに、当該技術分野で公知のハイブリドーマテクノロジーを含んでいてもよい。]
[0037] 本発明によれば、抗体またはその結合フラグメントは、標的タンパク質またはその抗原性フラグメントに特異的に結合可能なものを含み、その抗体がインビボで投与される場合にはその抗体によって認識されるエピトープを含むのが好ましい。抗体は、動物の宿主内で標的タンパク質由来の免疫原化成分での免疫処理によって誘発することが可能であり、あるいは、免疫性細胞のインビトロ免疫処理（感作）によって形成することが可能である。また抗体を、適当な細胞系が適当な抗体エンコーディングＤＮＡで形質転換、トランスフェクト、感染、または形質導入した組換え系において製造することも可能である。あるいは、抗体を、精製した重鎖および軽鎖の生化学的再構成によって構成することもできる。]
[0038] 抗体は、ヒト、またはヒト以外の動物、好ましくはマウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびブタといった哺乳類、またはニワトリのような鳥類由来のものであってもよい。マウスのモノクローナル抗体および抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントの一部(portions)が好ましい。加えて、キメラ抗体およびハイブリッド抗体が本発明の範囲に含まれる。キメラ抗体を製造する技術は、例えば、モリソン(Morrison)ら、１９８４、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855；ネオベルガー(Neuberger)ら、１９８４、Nature、312:604-608；および、タナカ(Tanaka)ら、１９８５、Nature、314:452-454に記載されている。ヒトの治療用としては、ヒト化抗体、またはより好ましくはヒトの抗体が用いられる。]
[0039] さらに、一本鎖抗体も本発明に適している（例えばヒューストン(Huston)、米国特許番号5,476,786および5,132,405；ヒューストンら、１９８８、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883；ラドナー(Ladner)ら、米国特許出願4,946,778；バード(Bird)、１９８８、Science, 242:423-426、およびワード(Ward)ら、１９８９、Nature, 334:544-546を参照）。一本鎖抗体は、アミノ酸ブリッジを介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖免疫グロブリンフラグメントを結合することで形成され、最終的に一本鎖ポリペプチドになる。一価抗体も本発明の範囲に含まれる。]
[0040] 抗体の送達用として多くの送達の径路が当業者間で知られている。例えば、抗体を関心部位に送達するのには直接注入が適切であり得る。抗体を膜中に持つリポゾームを使用して、標的遺伝子の発現または機能を阻害する必要のあるエリアにリポゾームを特異的に送達することも可能である。これらのリポゾームを、モノクローナル抗体のみならず上記のような他の治療薬を含むよう製造することも可能である。それらはその後、標的部位で放出されることになる（例えばウルフ(Wolff)ら、１９８４、Biochem. et Biophys. Acta, 802:259参照）。]
[0041] （アンチセンス核酸分子）
本発明の他の実施態様では、ＰＣ４遺伝子またはＤＮＡトポイソメラーゼＩ遺伝子（「標的遺伝子」）の発現を阻害する目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。細胞中のアンチセンスＲＮＡの発現、好ましくは恒常的発現は、おそらくは翻訳の妨害またはスプライシングの阻害を通じて遺伝子の発現を阻害することが知られている。この点に関して、スプライシングを伴う干渉では、保存が少ないはずのイントロン配列の使用が可能になるので、結果的に特異性が増大し、ある種の遺伝子生成物の発現は阻害されるが他の種の相同体は阻害されないようになる。]
[0042] 「アンチセンス成分」という用語は、ＤＮＡ配列のみならずＲＮＡ配列にも対応しており、アンチセンスＲＮＡが特異的に、ｍＲＮＡの翻訳が阻害されるようにアンチセンスＲＮＡとｍＲＮＡとの間に分子ハイブリダイゼーションを引き起こすように、特定のｍＲＮＡ分子に対し十分な相補性を有している。そのようなハイブリダイゼーションがインビボ条件下で生じる可能性もある。このアンチセンス分子は標的遺伝子に対して、長さにして１８〜３０ヌクレオチド程度の十分な相補性を有するものでなければならない。それにより、その作用がスプライシング、転写または翻訳のレベルであるかどうかとは関係なく、アンチセンスＲＮＡが標的遺伝子（またはｍＲＮＡ）とハイブリダイズすることができ、標的遺伝子発現を阻害することができる。本発明のアンチセンス成分は、コーディング配列、３’もしくは５’非翻訳領域またはその他のイントロン配列を含む標的ｃＤＮＡの幾つかの部分のいずれか、あるいは標的ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なものであってもよい。当業者であれば、アンチセンス分子が公知のｍＲＮＡ配列に基づいて容易に設計可能であることをすぐ理解するであろう。]
[0043] アンチセンスＲＮＡは、レトロウィルスベクターおよびプラスミドを含むベクターを介した形質転換またはトランスフェクションによって細胞まで送達され、ベクター中に、プロモータを含め適切な調節配列を持つアンチセンスＲＮＡをエンコーディングしているＤＮＡが配置されているので、宿主細胞中でアンチセンスＲＮＡの発現が生じる。一実施態様では、アンチセンス方向の標的ｃＤＮＡフラグメントを含むベクターの安定したトランスフェクションおよび恒常的発現が得られる。あるいは、そのような発現が、組織または発生特異的プロモータの制御下にあってもよい。リポゾームにより送達を達成することもできる。]
[0044] インビボ治療法に関して、現在好ましいとされる方法は、発現ベクター内に構築されたアンチセンスｃＤＮＡフラグメントの安定トランスフェクションの代わりに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを直接送達することである。サイズとしては長さが１５〜３０塩基で、コーディング配列、３’もしくは５’非翻訳領域または他のイントロン配列を含む標的ｃＤＮＡの幾つかの部分のいずれか、あるいは標的ｍＲＮＡとハイブリダイズ可能な配列を備えるアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。ターゲッティング用のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する配列として、最も強力なアンチセンス効果を持つものが選択されることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列用の標的部位に影響を及ぼす要因には、オリゴヌクレオチドの長さ、結合親和性、および標的配列の接近可能性(accessibility)が含まれる。配列は、標的タンパク質の翻訳および標的に関連する表現型の阻害（例えば培養中の細胞における細胞増殖の阻害）を計測することによって、そのアンチセンス活性の効力に関してインビトロでスクリーニングされてもよい。通常、ＲＮＡのほとんどの領域（５’および３’非翻訳領域、ＡＵＧ開始、コーディング領域、スプライスジャンクション、およびイントロン）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてターゲッティング可能であることが知られている。]
[0045] 好ましい標的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安定性があり、高いヌクレアーゼ耐性を持ち、非毒性の薬量で標的の組織部位への運搬を可能にする適度な薬物動態を備え、原形質膜を透過する(cross through)能力を有するこれらのオリゴヌクレオチドである。]
[0046] ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてもよい。ヘテロ環またはその糖の修飾のみならずホスホジエステル結合の修飾により高い効果が得られる可能性がある。ホスホロチオエートは、ホスホジエステル結合を修飾させるのに用いられる。Ｎ３’−Ｐ５’アミド亜リン酸エステル結合は、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対し安定化させ、ＲＮＡとの結合を増加させるものとして記載されてきた。ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合は、リボースおよびホスホジエステルのバックボーンの完全な代替物(replacement)であり、ヌクレアーゼに対し安定であり、ＲＮＡへの結合親和性を向上させ、ＲＮａｓｅＨによる切断を防ぐ。その塩基構造も、アンチセンス成分としてのその最適化を可能にする修飾の対象となる。ヘテロ環の修飾に関して、所定のヘテロ環の修飾は、ＲＮＡｓｅＨ活性に干渉せずにアンチセンス効果を高めることが証明されている。そのような修飾の一例がＣ−５チアゾール修飾である。最後に、糖の修飾も考えられる。２’−Ｏ−プロピルおよび２’—メトキシエトキシリボース修飾は、細胞培養中およびインビボのヌクレア−ゼに対してオリゴヌクレオチドを安定させる。]
[0047] 送達径路は、上記の基準に従って計測した場合に最適なアンチセンス効果をもたらすものになり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたインビトロ分析およびインビボ分析により、カチオン性リポゾームやレトロウィルスベクターにより媒介される送達および直接送達が有効であることが証明された。それ以外に考えられる送達モードは、標的細胞の細胞表面マーカーに対する抗体を用いてのターゲッティングである。標的またはそのレセプタに対する抗体をこの目的に利用できる。
（低分子干渉ＲＮＡ分子）
さらなる実施態様では、標的遺伝子の発現が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（ＲＮＡｉ、ＲＮＡ干渉核酸としても知られている）によって阻害されていてもよい。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ分子で、通常は長さが２１ｎ．ｔ．、標的遺伝子に対し相同的であって、標的遺伝子の活性に干渉する。]
[0048] ｓｉＲＮＡテクノロジーは、真核細胞に生じ得る配列特異的転写後遺伝子抑制のプロセスに関連する。通常このプロセスは、特定の配列のｍＲＮＡの分解を伴うものであり、その分解は、上記の特定の配列と相同形である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘発される。例えば、特定の一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓｍＲＮＡ）の配列に対応する長いｄｓＲＮＡの発現は、そのメッセージを不安定にし、それによって、対応する遺伝子の発現に「干渉する」。したがって、選択されるいずれの遺伝子も、その遺伝子に関するｍＲＮＡの全てまたは本質的な部分に対応するｄｓＲＮＡを導入することによって抑制され得る。長いｄｓＲＮＡが発現するとき、それはまずリボヌクレアーゼＩＩＩによって、長さにして塩基ペアが２１〜２２程度しかない、より短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドになるよう処理される。したがって、比較的短い相同形ｄｓＲＮＡの導入または発現によりｓｉＲＮＡを生じさせてもよい。実際、比較的短い相同形ｄｓＲＮＡを使用することで、以下に述べるような所定の効果が得られるとも思われる。]
[0049] 哺乳動物細胞は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の影響を受ける少なくとも２本の系路を持つ。上記のように、ｓｉＲＮＡ（配列特異性）系路では、まず開始ｄｓＲＮＡが複数の短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡに分解(break)される。ｓｉＲＮＡは、各３’末端において２つのヌクレオチドが突出している(overhang)１９ヌクレオチド程度のｓｉＲＮＡを形成する約２１個のヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を持つ。短い干渉ＲＮＡは、特異的メッセンジャーＲＮＡが分解のためターゲッティングされることを可能にする配列情報を提供すると考えられる。対照的に、非特異的系路は、長さにして約３０個以上の塩基対であれば、いずれかの配列のｄｓＲＮＡによって引き起こされる。]
[0050] 非特異的効果は、ｄｓＲＮＡが２つの酵素すなわちＰＫＲと２’，５’オリゴアデニル酸シンテターゼを活性化することから生じる。ＰＫＲは、活性形態では翻訳開始因子ｅＩＦ２をリン酸化して、全てのタンパク質合成を遮断する。また、２’，５’オリゴアデニル酸シンテターゼ（２’，５’−ＡＳ）は、全てのｍＲＮＡをターゲッティングしている非特異的酵素であるＲＮａｓｅＬを活性化する分子を合成する。非特異的系路は、ストレスやウイルス性感染に対する宿主反応を表すこともあり、通常は、非特異的系路の影響が最小限度であるのが好ましい。重要なのは、非特異的系路を誘導するには長めのｄｓＲＮＡが必要と思われることで、したがって、約３０塩基対より短いｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉによる遺伝子抑制効果があるとして好まれる（ハンター(Hunter)ら、１９７５、J. Biol. Chem. 250:409-17；マンシェ(Manche)ら、１９９２、Mol. Cell. Biol. 12:5239-48；ミンクス(Minks)ら、１９７９、J. Biol. Chem. 254: 10180-3；およびエルバシール(Elbashir)ら、２００１、Nature 411 :494-8参照）。ｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞およびＢＨＫ−２１細胞を含む様々なタイプの細胞において遺伝子発現を減少させる有効な手段であることが立証されており、通常は、アンチセンス技術を用いて達成されたものより低いレベルまで遺伝子の発現を減少させ、実際、発現を完全に無くすこともしばしば起こる（バス(Bass)、２００１、Nature 411 :428-9を参照）。哺乳動物細胞では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス実験で通常用いられる濃度より何桁も低い濃度で効果がある（エルバシールら、２００１、Nature 411 :494-8参照）。]
[0051] ＲＮＡｉを生じるために用いられる二本鎖オリゴヌクレオチドは、長さにして３０塩基対未満であるのが好ましく，より好ましくは約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８または１７塩基対のリボ核酸を含む。任意で、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドが、３’突出末端を含んでもよい。典型的な２−ヌクレオチド３’突出は、いずれのタイプのリボヌクレオチド残基で構成されていてもよく、２’−デオキシチミジン残基で構成されていてもよい。これによりＲＮＡ合成のコストが抑えられ、また、細胞培養の培地およびトランスフェクトされた細胞内のｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性も向上し得る（エルバシール(Elbashi)ら、２００１、Nature 411 :494-8参照）。]
[0052] ５０、７５、１００または５００以上にもなる塩基対のさらに長いｄｓＲＮＡも、本発明の所定の実施態様で用いられる。ＲＮＡｉを生じるためのｄｓＲＮＡの典型的な濃度は、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭまたは１００ｎＭである。ただし、処理される細胞の性質、遺伝子標的およびその他、当業者にとって容易に認められる要因によっては、それ以外の濃度を用いてもよい。]
[0053] 典型的なｄｓＲＮＡは、化学的に合成してもよく、または適切な発現ベクターを用いてインビトロまたはインビボで製造してもよい。典型的な合成ＲＮＡには、当該技術分野で公知の方法を用いて化学的に合成された２１個のヌクレオチドＲＮＡが含まれる。合成オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて脱保護およびゲル精製されるのが好ましい（例えばエルバシールら、２００１、Genes Dev. 15: 188-200を参照）。より長いＲＮＡは、例えば当該技術分野で公知のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータのようなプロモータから転写されてもよい。単一ＲＮＡ標的は、インビトロプロモータの下流で双方の可能な方位に設けられているものであり、標的の両方の鎖を転写して所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成する。上記ＲＮＡ種はいずれも、標的核酸において表現される核酸配列の部分を含むよう設計されてもよい。]
[0054] オリゴヌクレオチドの設計に利用される特異的な配列は、標的の発現遺伝子メッセージ内に含まれるヌクレオチドのいずれの隣接配列であってもよい。当該技術分野で知られているプログラムとアルゴリズムを適切な標的配列を選択する目的で用いてもよい。それに加え、特定の一本鎖核酸配列の二次構造を予測するよう設計されたプログラムを利用し、またそれらの配列の選択が，折りたたまれたｍＲＮＡの露出一本鎖領域で生じやすいようにして、最良の配列を選択してもよい。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法および組成物が，例えば、米国特許番号No. 6,251,588に記載されており、その内容は参照用としてここに挿入されている。]
[0055] ｍＲＮＡは通常、リボヌクレオチドの配列中にタンパク質合成を指示する情報を含む直線分子であると考えられているが、ほとんどのｍＲＮＡが多数の二次および三次構造を含むことが証明されている。ＲＮＡ中の二次構造エレメントは、主として同じＲＮＡ分子の異なる領域間でのワトソン・クリック型相互作用によって形成される。重要な二次構造エレメントには、分子内二本鎖領域、ヘアピンループ、二重鎖ＲＮＡのバルジおよび内部ループが含まれる。三次構造エレメントは、二次構造エレメントが互いに、または一本鎖領域と接触してより複雑な三次元の構造を作ったときに形成される。これまで数多くの研究者らが非常に多くのＲＮＡ二重構造の結合エネルギーを計測してきたし、また、ＲＮＡの二次構造を予測するのに使用可能な一連の規則を推測してきた（例えば、ジェーガー(Jaeger)ら、１９８９、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706；およびターナー(Turner)ら、１９８８、Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17: 167を参照）。それらの規則はＲＮＡ構造エレメントの同定，特に、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンステクノロジーを標的とするｍＲＮＡの好ましいセグメントを表し得る一本鎖ＲＮＡ領域の同定に用いられる。したがって、ｍＲＮＡ標的の好ましいセグメントは、本発明の適切なリボザイムおよびハンマーヘッド型リボザイム(hammerheadribozyme)組成物のみならずｓｉＲＮＡ媒介ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計についても同定可能である（以下参照）。]
[0056] リポゾーム等の担体組成物を用いた異種標的遺伝子でのトランスフェクションによって、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを細胞に導入してもよい。当該技術分野で知られているリポゾームとしては、例えば接着細胞系のメーカーによって記載されているようなリポフェクタミン(Lipofectamine)２０００（ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)）が挙げられる。ターゲティング内因性遺伝子についてのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを、オリゴフェクタミン(Oligofectamine)（ライフ・テクノロジーズ）を用いて実施してもよい。ｈＧＦＰ−エンコーディングｐＡＤ３との同時トランスフェクション後に、哺乳動物細胞用の蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクション効率をチェックしてもよい（ケーレンバック(Kehlenback)ら、１９８８、J. Cell Biol. 141 :863-74参照）。ｓｉＲＮＡの有効性については、ｄｓＲＮＡ導入後に，数多くの分析のいずれを用いて評価してもよい。それらの分析には、新しいタンパク質合成を抑制した後で内因性貯留(endogenous pool)の代謝回転に十分な時間をかけてから標的遺伝子生成物を認識する抗体を用いるウエスタンブロット解析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、および、存在する標的ｍＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット解析も含まれる。]
[0057] ｓｉＲＮＡテクノロジーのさらなる組成物，方法および適用については、米国特許番号6,278,039、5,723,750および5,244,805に記載されており、それらは参照用としてここに挿入されている。]
[0058] さらなる実施態様における本発明は、ＰＣ４が癌タンパク質であり阻害用化合物の標的になり得るという上記発見に基づく、癌阻害剤に関するスクリーニング方法を提供するものである。本発明のスクリーニング方法は、例えば、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子といった適切なレポータ遺伝子に結合したＰＣ４プロモータ配列（例えばＦＩＧ．１Ａ参照）を用いるプロモータ系スクリーニングである。当業者であれば、ここで例示されている典型的な配列以外にも、ＰＣ４遺伝子に対する多くの適切なプロモータ配列またはその他のシス作用転写因子(cis-acting transcriptional factors)が入手可能であり，かつ使用可能であることを理解するであろう。]
[0059] また、本発明のスクリーニング方法は、ＰＣ４依存型転写分析[例えば、ゲとレーダーに記載（１９９４）、クラスＩＩ遺伝子の転写活性化を媒介するヒトのコアクチベータ、ＰＣ４の精製、クローニングおよび特性評価(Purification, cloning and characterization of a human coactivator, PC4, that mediates transcriptional activation of class II genes)。Cell 78, 513-523参照]、またはタンパク質−タンパク質相互作用分析、またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用分析[例えば、ゲ(Ge), H. (２０００) UPA, タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ、およびタンパク質−リガンド相互作用の定量検出用ユニバーサル・プロテイン・アレイシステム(a universal protein array system for quantitative detection of protein-protein, protein-DNA, protein-RNA and protein-ligand interactions)。Nucleic AcidsRes. 28, e3参照]のような、タンパク質活性に基づく分析であってもよい
本発明の診断またはスクリーニング方法は、十分に確立され当業者間公知である、タンパク質または核酸に基づく多くの分析方法に基づくものであってもよい。抗ＰＣ４抗体および抗トポイソメラーゼＩ抗体は、公知であり市販されている。例えば、金のナノ粒子と共役している抗体をバイオアッセイワークス(BioassayWorks)（イジャムスヴィル(Ijamsville)、メリーランド）から入手して、ＰＣ４タンパク質またはトポイソメラーゼＩのレベルを早急かつ定量的にモニタリングするのに用いることができる。同様に、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）分析を、ＲＮＡレベルでのＰＣ４とトポイソメラーゼＩの活性化をモニタリングするのに用いることができる。]
[0060] 当業者であれば，本発明の「対象者(subject)」が、腫瘍が生じやすいヒトおよびヒト以外の動物を含むことを理解している。]
[0061] 当業者であれば、本発明の「癌治療法」が、化学療法、放射線療法、免疫療法、および、それらの組み合わせを含むことを理解している。]
[0062] 本発明の癌阻害剤は、単独で，もしくは、１つまたは複数の公知または非公知の癌阻害剤と組み合わせて、癌を阻害または治療するのに有効な量で、対象者に投与可能である。「有効量」とは、何らかの有害な副作用があっても利点がそれを上回る、対象者に害を及ぼさない量であると理解される。有効な投与量は、年齢、体重、および治療される対象者、投与のモードおよび径路、および、阻害または治療が求められる癌または腫瘍のタイプによって変更され得る。]
[0063] 本発明の癌阻害剤の投与量および径路は、余分な実験を行わずとも、全ての基準（特定の種類の薬剤についてリストアップ済みのものを含む）を考慮し、またその対象者についてベストの判断を行使して、当業者が決定することが可能である。]
[0064] さらに、ＰＣ４依存型悪性腫瘍の治療用の医薬剤としての突然変異型ＰＣ４タンパク質の使用が意図されている。Ｎ−末端セリンリッチドメインがＰＣ４の活性にとって非常に重要でありカゼインキナーゼＩＩリン酸化によって制御されていることは既に報告されている。Ｎ−末端領域の欠失によって、そのコアクチベーターの活性が完全に消失した。一連の点突然変異を発生させることによりＰＣ４活性に必要な重要なアミノ酸類を、ここでマッピングおよび開示する。野生型ＰＣ４と共に７種の突然変異型ＰＣ４タンパク質が発現、精製され、それらの活性が、１）電気泳動移動度シフト分析、２）インビトロ転写分析、および３）タンパク質アレイ分析でテストされた。ＰＣ４のＤＮＡ結合活性および転写活性を消失させるＦ７７（Ｆ７７Ｐ）での単一アミノ酸変化に加え、Ｎ−末端塩基領域での２つの二重突然変異種（Ｋ２３Ｉ／Ｋ２９ＡおよびＫ３５Ｉ／Ｋ４１Ａ）ならびに三重突然変異種（Ｒ２７Ａ／Ｋ２８Ｉ／Ｋ２９Ａ）もまた、ＰＣ４活性を激減させる。よって、ＰＣ４突然変異体Ｆ７７Ｐ、Ｋ２Ｉ／Ｋ２９Ａ、Ｋ３５Ｉ／Ｋ４１Ａ、およびＲ２７Ａ／Ｋ２８Ｉ／Ｋ２９Ａは、内因性野生型ＰＣ４と競合することによって、癌阻害試薬として用いることができ、ＰＣ４依存型悪性腫瘍に対する治療効果が得られた。]
[0065] さらに、ＰＣ４の活性化ドメインに対応する短いペプチドの、癌阻害剤としての使用も意図されている。一般的な転写コアクチベーターとして、一般的な転写因子(類)、アクチベーター、および鋳型ＤＮＡとの相互作用は全てＰＣ４活性にとって必要である。ＰＣ４活性化ドメインアミノ酸１６−３０（ＤＳＤＳＥＶＤＫＫＬＫＲＫＫＱ）および２６−４０（ＫＲＫＫＱＶＡＰＥＫＰＶＫＫＱ）に対応する２つのペプチドが合成され、またＰＣ４に対するそれらの阻害効果が、タンパク質−タンパク質相互作用およびインビトロ転写分析においてＰＣ４とアクチベーターの相互作用と競合させることによりテストされてもよい。]
[0066] また、癌阻害剤としての人為的活性化ドメインの使用も意図されている。ＰＣ４の発癌性活性が、全部とはいかなくても大部分の癌遺伝子、成長因子、およびその他の腫瘍形成因子の発現を、それらの特異的なアクチベーターとの相互作用を通じて活性化させる転写コアクチベーターとして機能するため、内因性アクチベーターとＰＣ４の結合活性をブロックすることにより、ＰＣ４のアクチベーター活性を消失させることができた。１５個のアミノ酸を持つ両親媒性らせん（ＡＨ）ペプチドはテストされ、ＰＣ４との相互作用が強い活性化ドメインを模倣させる(mimic)ことができた。Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとの融合により、ＰＣ４依存方式での劇的な転写活性化が生じた。ＡＨペプチド（ＥＬＱＥＬＱＥＬＱＡＬＬＱＱＱ）は、合成され、ＰＣ４と結合する他の内因性アクチベーターと競合させることによりＰＣ４に対するその阻害効果についてテストされてもよい。]
[0067] また、腫瘍細胞に対するＰＣ４タンパク質関連試薬の進入を容易にするための転移ドメイン（ＴＬＤ）の使用も意図されている。転移ドメイン（ＴＬＤ）は、１２個のアミノ酸（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰ）で構成された、分子量１２８８．４７（ｐＩ＝６．２７）の短いペプチドである。このペプチドが、Ｂ型肝炎ウイルス感染および他のタンパク質の細胞透過性にとって重要であることが報告された（エスおよびヒルト(Oess and Hildt)２０００；ステッケルら(Stoeckl et al.)、２００６）。タンパク質関連癌阻害剤が核癌タンパク質ＰＣ４をターゲティングできるように、ＴＬＤは、組換え型モノクローナル抗体、ＰＣ４突然変異体タンパク質、ＰＣ４活性化ドメインに対応するペプチド、両親媒性らせんペプチドおよびその他、ＰＣ４活性を阻害できるタンパク質またはペプチド類と融合させられてもよい。ＨＩＶｔａｔタンパク質のＴＬＤといった他のタイプの転移ドメインもテストされ得る。]
[0068] ＰＣ４活性を阻害する化合物をスクリーニングするためのハイスループットシステム（ＨＴＳ）も意図されている。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）テクノロジーは、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、およびタンパク質立体配座変化といった分子動力学を量化するハイスループットスクリーニング分析において有効なツールであった。ハイスループットＦＲＥＴ分析システムは、９６ウェルまたは３８４ウェルのプレートフォーマットで開発されており、それによれば、蛍光標識された両親媒性らせん（ＡＨ）ドメインはエネルギードナーとして作用し、蛍光標識されたＰＣ４タンパク質はエネルギーアクセプターとして作用する。２つの分子の相互作用によりドナーとアクセプターが近接している（１〜１０ｎｍ）ところで一旦ＰＣ４−ＡＨ複合体が形成されると、ＡＨドメインからＰＣ４タンパク質への分子間ＦＲＥＴが原因で、ＰＣ４の発光(emission)が顕著になる。ＡＨペプチドの励起とＰＣ４発光は、蛍光プレートリーダーによりモニタリングされる。どの化合物の阻害効果も、読取り値の変化をモニタリングすることにより検出できる。これらの化合物は、ＰＣ４依存型悪性腫瘍用の潜在的な癌阻害剤候補としてさらに確認され、また開発され得る。２種類の化合物、すなわち１）低分子量合成分子，および２）天然化合物、がスクリーニングされることになろう。]
[0069] 低分子量合成分子は、市販および組織体内(in-house)のコレクションを含む。登録済みの搬入化合物を９６ウェルまたは３８４ウェルプレートに保存した後、目録データベースが設定され得る。反応プレートのウェルはそれぞれ、１０〜５０μｌの（３８４ウェルプレートについては１０μｌ、９６ウェルプレートについては５０μｌ）蛍光標識されたＰＣ４およびＡＨを含む反応混合物中にテスト済みの化合物１ｍＭを含む。プレートはそれぞれ陽性コントロール（１０ｍＭの標識されていないＡＨ）のウェルを４つ、および陰性コントロール（蛍光標識されたＡＨドナーの代わりにＨ２Ｏ）のウェルを４つ含む。その後、ＯＤ５３５での発光が、プレートリーダー（モレキュラー・ダイナミックス(Molecular Dynamics)）で計測される。予備の(preliminary)陽性分子について、インビトロタンパク質−タンパク質相互作用分析、転写分析、細胞系分析および、臨床試験前の動物実験を含む別々の分析を用いてさらに確認されてもよい。]
[0070] 処方薬の大部分が天然化合物で構成される。市販の抗腫瘍剤および抗感染剤のうち５０％を上回る分が、天然の生成物を原料としている。ＰＣ４活性を阻害可能な天然分子を同定する目的で、土壌微生物、海洋微生物、植物、およびその他のソースが、ＨＴＳ ＰＣ４−ＡＨＦＲＥＴ分析を用いてスクリーニングされることになり得る。同定された生の原料については、異なる分析システムでさらに精製、特性評価、および確認がなされてもよい。]
[0071] 以下の実施例は、本発明を分かりやすくする目的で提示されるものに過ぎず、本発明の範囲を限定する意図で提示されるものではない。]
[0072] （実施例１）
[材料および方法]
＜突然変異種生成＞
特異的点突然変異種を含む二本鎖オリゴは、異なる点突然変異種を生じるためのバクテリア発現ベクターにおいてＰＣ４の野生型領域に取って代わるものとして商業的に合成され使用されていた。各突然変異構造物は、配列解析によって確認され大腸菌中で発現した。バクテリア発現ＰＣ４タンパク質（野生型と突然変異体を含む）は、２段階の精製法、すなわち１）Ｐ１１ホスホセルロースおよび２）ヘパリンセファロース精製法によって製造される。ブラッドフォード法を用いて精製済みのタンパク質の濃度を計測し、ＳＤＳ—ＰＡＧＥを用いてその純度を検査した。]
[0073] ＜電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）＞
ＰＣ４タンパク質のｄｓ−ＤＮＡ結合活性を測定する目的でＥＭＳＡが用いられ、このＥＭＳＡは、１０ｎｇの精製ＰＣ４タンパク質およびアデノウィルスの主要後期プロモータ領域(major late promoter region)由来の３２Ｐ−標識６４ｂｐのｄｓＤＮＡプローブを含む２０μｌの反応混合物で実施された。４℃で１時間インキュベートした後、反応混合物を８％ポリアクリルアミドゲル上で解析した。移動したＰＣ４−ｄｓＤＮＡ複合体を、オートラジオグラフィーを用いて可視化した。]
[0074] ＜インビトロ転写分析＞
ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む精製済みの一般的な転写因子で、インビトロ転写分析系を再構築した。それらはＨｅＬａ細胞または組換えソースから精製されたものである。この系は、ＰＣ４中で、アクチベーター依存式の方法で活性化可能である。転写因子に加え、その系はまた、１つのアクチベーター反応性鋳型、塩基性鋳型（アクチベーター独立型）および３２Ｐ−ＣＴＰを含んでいた。３０℃で１時間インキュベートした後、新たに合成されたＲＮＡを抽出し、変性ポリアクリルアミドゲル上で解析して、オートラジオグラフィーを用いて可視化した。]
[0075] ＜タンパク質アレイ分析＞
タンパク質アレイ分析は「ユニバーサル・プロテイン・アレイ(Universal Protein Array)方法」またはＵＰＡと呼ばれる方法[ゲ(Ge), H. (２０００) UPA,タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡおよび、タンパク質−リガンドの相互作用の定量測定用ユニバーサル・プロテイン・アレイシステム(a universal protein array system for quantitative detection of protein-protein, protein-DNA, protein-RNA and protein-ligand interactions) Nucleic AcidsRes. 28, e3]に基づく。精製されたタンパク質を確認し、標準化を行いさらにニトロセルロースシート上に配列させた。各スポットはサイズにしたがって１０〜１００ｎｇのタンパク質を含むよう直径１ｍｍで配列された。アレイ上でＰＣ４タンパク質と相互作用した標的のタンパク質は、転写因子ＴＦＩＩＡ、Ｇａｌ４、またはＳｐ１に対する抗体等の特異的抗体によって検出された。タンパク質−ＤＮＡ相互作用については、プローブＤＮＡが３２ｐ−ｄＣＴＰで標識化され、その結合ＤＮＡは、オートラジオグラフィーによってモニタリングされた。]
[0076] ＜アフリカツメガエル変態中のＰＣ４発現の検査＞
オタマジャクシの異なるステージから全タンパク質抽出物を準備し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。タンパク質がニトロセルロース膜にトランスファーされた後、差別的に発現したＰＣ４が、ヒトＰＣ４に対するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットにより検出され、ＥＣＬ方法により可視化された。]
[0077] ＜ＰＣ４−トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡観察＞
ヒトＰＣ４の野生型（ＷＴ）またはセリンリッチ領域突然変異体（ΔＳ）を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングして、ＨｅＬａＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、共焦点顕微鏡下で検体を観察した。]
[0078] ＜ノーザンブロット解析＞
全ポリＡＲＮＡを異なる細胞系から単離して、１％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分離した。ニトロセルロース膜にトランスファーした後、３２Ｐ−標識されたＰＣ４ｃＤＮＡと一緒にその膜をインキュベートすることにより、ＰＣ４ｍＲＮＡを検出した。２８Ｓおよび１８ＳリボゾームのＲＮＡが、ＥｔＢｒ染色によって可視化された。]
[0079] ＜腫瘍組織におけるＰＣ４発現の検査＞
米国国立衛生研究所のヒト組織ネットワークセンター(Center of Human Tissue Network)より、異なるヒト腫瘍組織およびそれらと対を成す正常な組織を入手した。全タンパク質が別々の組織から抽出された。ＰＣ４とＤＮＡトポイソメラーゼＩの発現レベルをウエスタンブロットにより検出した。この方法では、各組織からの合計５０μｇの全タンパク質を解析し、それぞれ抗ＰＣ４または抗トポＩポリクローナル抗体と共にインキュベートした。免疫組織化学（ＩＨＣ）解析用として、正常なヒト肺組織または肺の癌組織を含むスライドガラスを、国立衛生研究所より入手した。組織のスライドガラスをまずキシレンで２×１５分処理してから、エタノールの濃度を５分おきに１００％から７０％まで減少させながらインキュベートした。９５°で５分間処理し、Ｈ２ＯおよびＩｘＰＢＳでゆすぎ、３％の粉ミルクを含むブロッキング緩衝液でブロッキングした後で、それらのスライドガラスを抗ＰＣ４ポリクローナル抗体（ブロッキング緩衝液中で１：１０００）と共に、室温で１時間インキュベートした。余分な一次抗体を洗い流した後、スライドガラスを蛍光標識した二次抗体と共に３０分間インキュベートした。スライドガラスをゆすいだ後、蛍光顕微鏡下でＰＣ４抗原を検出した。]
[0080] （実施例２）
＜ＤＮＡ結合および転写の際のＰＣ４突然変異の効果＞
ＰＣ４のＮ−末端セリンリッチドメインは、ＰＣ４活性にとって非常に重要でありカゼインキナーゼＩＩリン酸化によって制御されることが知られている。実際、Ｎ−末端領域を欠失するとＰＣ４コアクチベーターの活性が完全に消失することが知られている。発明者らは、一連の点突然変異種を発生させることによってＰＣ４活性に必要な重要なアミノ酸をマッピングした(図２)。したがって、図２は、野生型ＰＣ４（ＰＣ４−ｗｔ）とＰＣ４の５つの突然変異種を示す。特定の残基位置でのアミノ酸置換を、その突然変異種（すなわちｍｔ）番号下の括弧内に示す。ｍｔ５に関しては、アミノ酸フェニルアラニンが、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を含む分子間相互作用に関与していることが知られている。先のデータより、ＰＣ４のｓｓＤＮＡ結合領域がアミノ酸残基７７の付近に局在することが分かる。野生型ＰＣ４と共に７種の突然変異型ＰＣ４タンパク質が発現および精製され（図３Ａ）、その活性について、１）電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ、図３Ｂ）、２）インビトロ転写分析（図３Ｃ）、および３）タンパク質アレイ解析(図４)で検査された。ＰＣ４のＤＮＡ結合活性と転写活性を消失させるＦ７７（Ｆ７７Ｐ）での単一アミノ酸変化に加え、Ｎ−末端塩基領域での２つの二重突然変異種（Ｋ２３Ｉ／Ｋ２９ＡとＫ３５Ｉ／Ｋ４１Ａ）および１つの三重突然変異種（Ｒ２７Ａ／Ｋ２８Ｉ／Ｋ２９Ａ）も、ＰＣ４活性を激減させる。よって、ＰＣ４の突然変異体Ｆ７７Ｐ、Ｋ２Ｉ／Ｋ２９Ａ、Ｋ３５Ｉ／Ｋ４１Ａ、およびＲ２７Ａ／Ｋ２８Ｉ／Ｋ２９Ａは、内因性野生型ＰＣ４との競合により癌阻害試薬として使用することができ、その結果、ＰＣ４依存型悪性腫瘍の治療効果があった。] 図２ 図３Ａ 図３Ｂ 図３Ｃ 図４
[0081] （実施例３）
＜ＰＣ４をＤＮＡおよびその他の転写因子に結合させる際のＰＣ４突然変異の効果＞
図４は、ポジション７７でのアミノ酸フェニルアラニンが、ＰＣ４のｓｓＤＮＡ結合活性にとって決定的であることを示す（図４Ｆのｍｔ５を参照）。一方、このＦ７７Ｐ点突然変異種（すなわちｍｔ５）は、ＰＣ４と転写因子ＴＦＩＩＡ(図４Ｃ参照)およびＳｐ１（図４Ｅ参照）との相互作用を増強する。それ以外の突然変異種は、ＰＣ４がＤＮＡおよびタンパク質であるＳｐＩやＴＦＩＩＡと相互作用する能力に対しほとんど、または全く影響しなかった。野生型ＰＣ４（ｗｔ）と個々の突然変異体（ｍｔ）が略同等に存在することが、ポンソーＳ染色(図４Ａ)および、抗ＰＣ４抗体での検出（図４Ｂ）によって確認された。Ｇａｌ４−（ｌ−９４）は、Ｇａｌ４−Ｓｐ１融合タンパク質とのＰＣ４の相互作用に対する陰性コントロールとして使用されている（図４Ｅ）。] 図４ 図４Ａ 図４Ｂ 図４Ｃ 図４Ｅ 図４Ｆ
[0082] （実施例４）
＜分化におけるＰＣ４の役割＞
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ＰＣ４活性化がアフリカツメガエルの変態に必要であることを示す。この結果は、オタマジャクシの発生のステージ５６〜５８の間にＰＣ４が活性化されることを示す。これは、リン酸化ＰＣ４（すなわちＰＣ４−Ｐ）（ＰＣ４の不活性形態）の発現が減少し非リン酸化ＰＣ４（すなわちＰＣ４の活性化形態）の発現が増加することから証明される。癌の転移プロセスに類似して、変態には多くの成長因子、転写因子、分化プロセスに関与する核ホルモンレセプタの活性化が必要であるため、これらのデータがＰＣ４と癌との関連性を裏付けるものとなる。アフリカツメガエルの変態は、オタマジャクシから成体への１種類の変化を経る（図５Ｃ参照）。数多くのホルモン（甲状腺ホルモンＴ３およびＴ４のような）が必要となるだけでなく、数多くの成長因子、核ホルモンレセプタ、および転写因子（甲状腺ホルモンレセプタＴＲαおよびＴＲβのような）が、細胞の成長および分化に必要である。ＰＣ４は、これらの因子を活性化させる上で重要な役割を果たすと考えられる。] 図５Ａ 図５Ｃ
[0083] （実施例５）
＜ＰＣ４がＨｅＬａ細胞中の染色体凝縮を引き起こす＞
図６は、ＰＣ４が核内に局在され、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされるときに染色体凝縮とアポトーシスを引き起こすことを示す。野生型ＰＣ４の細胞へのトランスフェクションにより、ＨｅＬａ細胞の染色体が凝縮されることが分かる（図６Ａのコントロールを図６ＢのＰＣ４と比較）。ＰＣ４のセリンリッチ領域突然変異種によるトランスフェクション（図６Ｃ）は、それ自体はもはやカゼインキナーゼＩＩによってリン酸化することは不可能であるが、染色体凝縮に加えて、核と細胞の形状が変化する（悪性腫瘍細胞に共通の特徴を表している）ことを示す。このデータは、癌が突然変異によって引き起こされ得ること、および突然変異がしばしば動原体領域に起こるという理論を裏付けるものである。これらのデータは、ＰＣ４が染色体に結合するのみならず、実際には動原体に結合することを示し、またそれによって、ＰＣ４の潜在的なメカニズム（すなわち、ＰＣ４は他のＤＮＡ修復酵素のＤＮＡとの結合を妨げることにより癌遺伝子として機能する）を示唆する。] 図６ 図６Ａ 図６Ｂ 図６Ｃ
[0084] （実施例６）
＜形質転換された細胞系および腫瘍細胞系におけるＰＣ４ｍＲＮＡの発現＞
図７は、ＰＣ４ｍＲＮＡが全ての形質転換細胞系および乳癌細胞系において検出可能であるが、初代ＮＩＨ３Ｔ３細胞系および非悪性マウス組織では検出不可能であることを示す。図７Ａは、細胞系ｍＲＮＡを用いてのノーザンブロットのレーンの略同等のローディング量を表す（１８Ｓおよび２８ＳｒＲＮＡについての染色により表示される）。図７Ｂは、陰性コントロール（ヒトｐ５２ｍＲＮＡ）の結果を示す。図７Ｃは、ＰＣ４ｃＤＮＡでハイブリダイゼーションがあることによって異なる細胞系においてＰＣ４ｍＲＮＡが発現することを示す。] 図７ 図７Ａ 図７Ｂ 図７Ｃ
[0085] （実施例７）
＜腫瘍組織におけるＰＣ４タンパク質の発現増加＞
図８は、多数のヒト腫瘍組織（Ｔ）におけるＰＣ４タンパク質がウエスタンブロット解析によって検出可能であるが、それに対応する正常な（Ｎ）ヒト組織では検出不可能であることを示す（図８Ｂ）。加えて、ＰＣ４の活性化は、幾つもの癌阻害薬剤として十分研究された標的であるＤＮＡトポイソメラーゼＩ（図８Ａ）の活性化と相関関係がある。] 図８ 図８Ａ 図８Ｂ
[0086] （実施例８）
＜肺腫瘍でのＰＣ４タンパク質の発現＞
図９は、ＰＣ４タンパク質がヒトの肺癌組織の全ての腫瘍細胞に蓄積する（図９Ｂ）が、非悪性の肺組織の正常な細胞には蓄積しない（図９Ａ）ことを示す。] 図９ 図９Ａ 図９Ｂ
[0087] これまでに本発明の幾つかの実施態様を記載してきたが、上記の内容が単なる解説であって本発明を限定するものではなく、実施例によって提示されているに過ぎないことは当業者にとっては明らかである。数々の部分的変更およびその他の実施態様もこの分野の技術範囲に含まれ、本発明の範囲およびその同等物に含まれるとされる。本発明の変形は当業者にとって容易に理解可能であろうし、本発明はそれらの代替案を含むとされる。さらに、当業者であれば数多くの変更に容易に思い至るであろうから、本発明を、ここに記載されているような構造および操作に厳密に限定することは望ましくなく、したがって、適切な変更および同等物全てが、本発明の権利範囲に含まれるものとして依拠されることになり得る。]
[0088] 配列番号１ ヒトＰＣ４のｃＤＮＡ配列
配列番号２ ヒトＰＣ４のコーディング領域
配列番号３ ヒトＰＣ４のアミノ酸配列
配列番号４〜１０癌阻害剤として使用される可能性のある指定ペプチドのアミノ酸配列]

权利要求:

請求項1
対象者の腫瘍を診断する方法であり、前記方法は前記対象者からサンプルが提供され、転写正補因子４（ＰＣ４）タンパク質のレベルを測定することを含み、コントロールサンプルに比べＰＣ４レベルが高ければ前記サンプルが腫瘍状であることが示される方法。
請求項2
前記腫瘍が悪性である請求項１に記載の方法。
請求項3
前記サンプルが、肺、膀胱、結腸、乳房、子宮内膜、甲状腺、小腸、および卵巣からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
請求項4
さらに前記サンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルを測定し、そのレベルをコントロール中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルと比較することを含み、コントロールサンプルに比べＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルが高ければ前記サンプルが腫瘍状であることが示される方法。
請求項5
対象者の腫瘍を診断する方法であり、前記方法は前記対象者からサンプルが提供され、前記サンプル中のＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルを測定することを含み、コントロールサンプルに比べＤＮＡトポイソメラーゼＩのレベルが高ければ前記サンプルが腫瘍状であることが示される方法。
請求項6
前記腫瘍が悪性である請求項５に記載の方法。
請求項7
対象者の癌治療をモニタリングする方法であり、前記方法は治療過程において複数回にわたり前記対象者からサンプルが提供され、前記サンプル中の転写正補因子４（ＰＣ４）タンパク質のレベルを測定し、治療過程において前記サンプル中の転写正補因子４（ＰＣ４）タンパク質のレベルを比較することを含み、サンプル中の転写正補因子４（ＰＣ４）タンパク質のレベルが低下していれば癌治療が成功していることが示される方法。
請求項8
前記サンプルが、肺、膀胱、結腸、乳房、子宮内膜、甲状腺、小腸、および卵巣からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
請求項9
前記癌治療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、化学療法と放射線療法との組み合わせ、化学療法と免疫療法との組み合わせ、放射線療法と免疫療法との組み合わせ、および、化学療法と放射線療法と免疫療法との組み合わせからなる群から選択される請求項７に記載の方法。
請求項10
癌阻害剤に関するスクリーニング方法であり、前記方法は（ａ）レポータ遺伝子に有効に結合しているＰＣ４遺伝子のプロモータ配列を含む遺伝子構造物を提供し、（ｂ）レポータ遺伝子を発現させる条件下で候補化合物を前記遺伝子構造物と接触させることを含み、前記レポータ遺伝子の発現を阻害する候補が癌阻害剤である方法。
請求項11
請求項１０の方法にしたがって同定される癌阻害剤。
請求項12
癌阻害剤に関するスクリーニング方法であり、前記方法は（ａ）ＰＣ４−依存型転写分析試料を提供し、（ｂ）候補化合物を前記分析試料に添加することを含み、ＰＣ４の転写を減少させる候補が癌阻害剤である方法。
請求項13
請求項１２の方法にしたがって同定される癌阻害剤。
請求項14
抗癌剤に関するスクリーニング方法であり、前記方法は（ａ）ＰＣ４−タンパク質相互作用分析試料またはＰＣ４−ＤＮＡ相互作用分析試料を提供し、（ｂ）候補化合物を前記分析試料に添加することを含み、ＰＣ４−タンパク質相互作用またはＰＣ４−ＤＮＡ相互作用を減少させる候補が抗癌剤である方法。
請求項15
請求項１４の方法にしたがって同定される抗癌剤。