抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体及び使用方法

专利摘要:
本開示は、トリパノソーマ・クルーズのエピトープを検出するための試薬及び該試薬を使用する方法に関する。
公开号:JP2011507553A
申请号:JP2010540872
申请日:2008-12-23
公开日:2011-03-10
发明作者:シーゲル，ロバート・ダブリユ；シヤー，デイネツシユ・オー；タイナー，ジヨーン・デイー；ツイーマン，ロバート・エヌ；テイーマン，ブライアン・シー；トウー，バイリン；ブロフイー，スーザン・イー；ホークスワース，デイビツド・ジエイ
申请人:アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 関連出願の情報
本願は、２００８年１２月２７日に出願された米国特許出願６１／０１７，０７１号（参照により、その内容は本明細書に組み込まれる。）の利益を主張する。]
[0002] 技術分野
本開示は、トリパノソーマ（スキゾトリパナム（Ｓｃｈｉｚｏｔｒｙｐａｎｕｍ））クルーズ抗原を検出又は定量するための方法、アッセイ及びキットに関する。]
背景技術

[0003] 寄生虫トリパノソーマ（スキゾトリパナム）・クルーズは、シャーガス病（アメリカトリパノソーマ症）を引き起こし、中南米及びメキシコの風土病である。穏やかな急性期の後、多くの感染者は症候の欠如、低い寄生虫数及び抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体の低い力価を特徴とする中間期に入る。慢性のＴ．ｃｒｕｚｉ感染症を有する者の約１０から３０％は心臓又は胃腸の機能不全を発症する。化学療法は先天的に感染した幼児及び児童のかなりの数を治癒させることができるが、慢性的な感染症を有する成人においては概ね無効である（Ｃｏｕｒａ， Ｊ．， ａｎｄ Ｓ． ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ．２００２．Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ．９７：３−２４）。Ｔ．ｃｒｕｚｉに慢性的に感染している発症国内の推定１，２００万人のうち約２５，０００人が、心臓律動の異常又はうっ血性心不全のために、毎年、この病気によって死亡している（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ． ２００６．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ（Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）．Ｉｎ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｖｏｌ．Ｒ． Ｇｕｅｒｒａｎｔ， Ｄ． Ｗａｌｋｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｗｅｌｌｅｒ， ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１０８２−１０９４）。]
[0004] シャーガスは、１９０９年にこの病気を初めて記載したブラジル人医師カルロス・シャーガスにちなんで名付けられた（Ｃｈａｇａｓ， Ｃ． １９０９ａ．Ｎｅｕｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｎ．Ｖｏｒｌａｕｆｉｇｅ Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇ．Ａｒｃｈ．Ｓｃｈｉｆｆ．Ｔｒｏｐｅｎｈｙｇ．１３：１２０−１２２； Ｒｅｄｈｅａｄ， Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ａｎｄ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｙｐｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２−１１）。シャーガスは、トリアトミダエ（Ｔｒｉａｔｏｍｉｄａｅ）の腸がトリパノソーマ属の新種である鞭毛中原虫を有していることを発見し、感染した虫に咬まれたマーモセット猿に寄生虫が伝達され得ることを実験的に証明することができた。シャーガスは、この病気を引き起こす病原性寄生虫をトリパノソーマ・クルーズと名付け（Ｃｈａｇａ ｓ，１９０９ａ）、その年の後ほど、スキゾトリパナム・クルーズと名付け（Ｃｈａｇａｓ， Ｃ．１９０９ｂ．Ｎｏｖａ ｔｒｉｐａｎｏｚｏｍｉａｓｅ ｈｕｍａｎａ：Ｅｓｔｕｄｏｓ ｓｏｂｒｅ ａ ｍｏｒｆｏｌｏｊｉａ ｅ ｏ ｃｉｃｌｏ ｅｖｏｌｕｔｉｖｏ ｄｏ Ｓｃｈｉｚｏｔｒｙｐａｎｕｍ ｃｒｕｚｉ ｎ． ｇｅｎ．， ｎ． ｓｐ．， ａｊｅｎｔｅ ｅｔｉｏｌｏｊｉｃｏ ｄｅ ｎｏｖａ ｅｎｔｉｄａｄｅ ｍｏｒｂｉｄａ ｄｏ ｈｏｍｅｍ．Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ．１：１５９−２１８）、いずれの名前にも、２０世紀の代わる頃に黄熱病、天然痘及び腺ペストの伝染病と闘ったブラジル人医師及び疫学者であるオスワルド・クルツが含まれている。]
[0005] チャールズ・ダーウィンは、「Ｇｒｅａｔ Ｂｌａｃｋ Ｂｕｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｍｐａｓ」に咬まれたためにメンドーザ付近のアンデス東部で感染し、この病気に罹患していた可能性がある。ダーウィンは、彼の日記、ビーグル号の船旅の中で症候を報告した。ダーウィンは若く、概ね、健康状態は良好であったが、６ヶ月前に、バルパライソ付近で、一ヶ月間、病気であったが、イギリスに帰国してからほぼ１年後の１９３７年には、奇妙な症候の群に断続的に苦しみ始め、残りの人生の大部分は不具となった。]
[0006] 風土病地域では、Ｔ．ｃｒｕｚｉは、主として、吸血トリアトミン虫によって伝達される。この病気は、輸血、静脈内薬の使用、先天的な伝染、性行為、臓器移植又は授乳によっても伝達され得る（Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ， Ａ．Ｌ． １９７６．Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ．１３０：９７−１０３； Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．， ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３５５−６１； Ｇｒａｎｔ， Ｉ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｕｔｅ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１１１：８４９−５１； Ｈｏｆｆ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．１９７８．Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａｓ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｎ ｕｒｂａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｗｉｎｓ．Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．７２：２４７−５０； Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ． １９８９．Ｉｓ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ａ ｎｅｗ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｏｕｒ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ？ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１１１：７７３−５； Ｓｋｏｌｎｉｃｋ， Ａ． １９８９．Ｄｏｅｓ ｉｎｆｌｕｘ ｆｒｏｍ ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａｓ ｍｅａｎ ｍｏｒｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｇａ ｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ？ Ｊａｍａ．２６２：１４３３）。現在、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対するワクチンは存在しない。]
[0007] 慢性的なＴ．ｃｒｕｚｉ感染の診断は、この寄生虫の生活環の複雑さを反映している。高熱の期間中、診断は、単純に、血液、脳脊髄液、固定された組織又はリンパ節中に寄生虫を同定することからなるが、感染の潜伏期間及び慢性段階の間、虫を検出することは困難である。外因診断法では、患者と疑われる者の血液にこれらの寄生虫が感染してから数週間後に、Ｔ．ｃｒｕｚｉに関して、媒介昆虫の腸内含量が調べられる。しかしながら、この操作は面倒であり、高価であり、感度が低い（Ｓｅｇｕｒａ， Ｅ． １９８７．Ｘｅｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｃｈａｇａｓ’ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｏｌ．Ｒ．Ｒ． Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｔｏｋａ， ｅｄｉｔｏｒｓ．ＣＲＣＰｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．４１−４５）。]
[0008] これに対して、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対する抗体に対する血清学的アッセイは、感染の迅速且つ安価な診断に対して極めて適している。これらの方法には、間接的免疫蛍光、間接的血球凝集、補体結合及び酵素イムノアッセイ（Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．， ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３５５−６１）が含まれる。旧来のアッセイに一貫して伴う問題は、非確定的な偽陽性結果の発生であった（Ａｌｍｅｉｄａ， ＬＣ， ｅｔ ａｌ．１９９７．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ． ３７：８５０−７； Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ， ２００６； Ｌｅｉｂｙ， Ｄ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．２０００．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ’． ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ， ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ， ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｋｉｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：６３９−４２）。]
[0009] 何れのアッセイも、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の代表的な標準となる血清学的診断として一般的には認められていない（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００７）。Ｔ．ｃｒｕｚｉＤＮＡを検出するために設計されているアッセイは、感度が低いことが明らかとなっている（Ｇｏｍｅｓ， Ｍ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ １９９９．Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｃ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．６０：２０５−１０）。容易に解釈される結果を与える放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）は、ほぼ２０年前に開発され、米国において確認的な検査としての使用が提案されてきた（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ， １９８９）。しかしながら、その感受性及び特異性は系統的に確証されていない。さらに、ＲＩＰＡの複雑性のために、研究状況以外でＲＩＰＡが広く使用されることは困難となっている（Ｌｅｉｂｙ ｅｔ ａｌ，２０００）。]
[0010] 患者の試料中に存在する抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を検出するために設計されたイムノアッセイは、迅速で信頼性の高い血清学的診断法を提供することができる。典型的には、このような診断キットは、較正用物質、陽性対照及び／又はパネルメンバーとして作用するための１つ以上の特異的抗体を使用する。しばしば、シャーガス高力価ヒト血漿及び／又は血清がスクリーニングされ、特定の量で陰性対照試薬中に添加される。陽性対照などのシャーガス品質管理試薬は、特異的なエピトープに対する抗体の存在に関してスクリーニングされるヒト血漿又は血清試料である。しかしながら、ヒト血清及び血漿試料を使用することは、幾つかの著しい欠点を有する。これらには、（１）増大する規制上の懸念、（２）高い力価及び特異性で大容量を調達することの困難さ、（３）ロット間の変動性、（４）性質決定に関する限界及び（５）費用が含まれる。]
[0011] 従って、較正用物質、陽性対照及び／又はパネル要素として機能するための特異的抗体に対する要望が本分野においてなお存在している。本開示は、新規抗体、これらの抗体を産生する細胞株及びこれらの抗体を作製する方法を提供することによって、現行のＴ．ｃｒｕｚｉイムノアッセイの問題（すなわち、増大する規制上の懸念、高い力価及び特異性で大容量を調達することの困難さ、ロット間の変動性、性質決定に関する限界及び費用）の幾つかを場合によって克服又は回避する。]
先行技術

[0012] Ｃｏｕｒａ， Ｊ．， ａｎｄ Ｓ． ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ、Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ、２００２年、９７、ｐｐ．３−２４
Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ（Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｖｏｌ．Ｒ． Ｇｕｅｒｒａｎｔ， Ｄ． Ｗａｌｋｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｗｅｌｌｅｒ， ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２００６年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１０８２−１０９４
Ｃｈａｇａｓ， Ｃ．、Ｎｅｕｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｎ．Ｖｏｒｌａｕｆｉｇｅ Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇ．Ａｒｃｈ．Ｓｃｈｉｆｆ．Ｔｒｏｐｅｎｈｙｇ、１９０９年ａ、１３、ｐｐ．１２０−１２２
Ｒｅｄｈｅａｄ， Ｓ．Ａ．他、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ａｎｄ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｙｐｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００６年、５３、ｐｐ．２−１１
Ｃｈａｇａｓ， Ｃ．、Ｎｏｖａ ｔｒｉｐａｎｏｚｏｍｉａｓｅ ｈｕｍａｎａ：Ｅｓｔｕｄｏｓ ｓｏｂｒｅ ａ ｍｏｒｆｏｌｏｊｉａ ｅ ｏ ｃｉｃｌｏ ｅｖｏｌｕｔｉｖｏ ｄｏ Ｓｃｈｉｚｏｔｒｙｐａｎｕｍ ｃｒｕｚｉ ｎ． ｇｅｎ．， ｎ． ｓｐ．， ａｊｅｎｔｅ ｅｔｉｏｌｏｊｉｃｏ ｄｅ ｎｏｖａ ｅｎｔｉｄａｄｅ ｍｏｒｂｉｄａ ｄｏ ｈｏｍｅｍ．Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ、１９０９年ｂ、１、ｐｐ．１５９−２１８
Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ， Ａ．Ｌ．、Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ、１９７６年、１３０、ｐｐ．９７−１０３
Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７年、１４、ｐｐ．３５５−６１
Ｇｒａｎｔ， Ｉ．Ｈ他、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｕｔｅ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、１９８９年、１１１、ｐｐ．８４９−５１
Ｈｏｆｆ， Ｒ．他、Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａｓ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｎ ｕｒｂａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｗｉｎｓ．Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．、１９７８年、７２、ｐｐ．２４７−５０
Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ．、Ｉｓ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ａ ｎｅｗ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｏｕｒ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ？ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、１９８９年、１１１、ｐｐ．７７３−５
Ｓｋｏｌｎｉｃｋ， Ａ．、Ｄｏｅｓ ｉｎｆｌｕｘ ｆｒｏｍ ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａｓ ｍｅａｎ ｍｏｒｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ？ Ｊａｍａ．、１９８９年、２６２、ｐｐ．１４３３
Ｓｅｇｕｒａ， Ｅ．、Ｘｅｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｃｈａｇａｓ’ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｏｌ．Ｒ．Ｒ． Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｔｏｋａ， ｅｄｉｔｏｒｓ．ＣＲＣＰｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，、１９８７年、ｐｐ．４１−４５
Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、１４、ｐｐ．３５５−６１
Ａｌｍｅｉｄａ， ＬＣ他、Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．、１９９７年、３７、ｐｐ．８５０−７
Ｌｅｉｂｙ， Ｄ．Ａ．他、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ’． ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ， ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ， ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｋｉｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００年、３８、ｐｐ．６３９−４２
Ｇｏｍｅｓ， Ｍ． Ｌ．他、Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｃ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．、１９９９年、６０、ｐｐ．２０５−１０]
発明が解決しようとする課題

[0013] 本開示の目的は、トリパノソーマ（スキゾトリパナム）クルーズ抗原を特異的に結合する抗体（組換え抗体及びキメラ抗体を含む。）及びその使用を提供することである。]
課題を解決するための手段

[0014] 本開示の一態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合することができる組換え抗体（キメラ抗体を含む。）が提供される。抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドに対して特異的な抗体からなる群から選択される。]
[0015] 本開示の一態様において、抗体は前記抗体であり、以下からなる群から選択される。]
[0016] （ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体は、約７．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約７．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約４．０×１０−３ｓ−１から約３．０×１０−１ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約５．７×１０−１０Ｍから約４．３×１０−７Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体は、約１．０×１０６Ｍ−１ｓ−１から約８．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約６．０×１０−３ｓ−１から約４．０×１０−２ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約７．５×１０−１０Ｍから約４．０×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体は、（ａ）約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１から約３．０×１０５Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、（ｂ）約１．０×１０−４ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び（ｃ）約３．３×１０−１０Ｍから約１．６×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体は、約２．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約６．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約２．０×１０−５ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約３．３×１０−１２Ｍから約４．０×１０−９Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。]
[0017] 本開示の別の態様において、抗体は、ＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体である。場合によって、抗体は、ＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から選択される細胞株によって発現される。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−ＩＧ（Ｒ））又はこれらの断片である。]
[0018] 本開示の別の態様において、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができるこれらの抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）の１つ以上を含む免疫診断試薬が提供され、抗体はＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡからなる群から選択される。]
[0019] 本開示の別の態様に従えば、免疫診断試薬は以下からなる群から選択される抗体を含む。]
[0020] （ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体は、約７．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約７．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約４．０×１０−３ｓ−１から約３．０×１０−１ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約５．７×１０−１０Ｍから約４．３×１０−７Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体は、約１．０×１０６Ｍ−１ｓ−１から約８．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約６．０×１０−３ｓ−１から約４．０×１０−２ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約７．５×１０−１０Ｍから約４．０×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体は、（ａ）約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１から約３．０×１０５Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、（ｂ）約１．０×１０−４ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び（ｃ）約３．３×１０−１０Ｍから約１．６×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体は、約２．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約６．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約２．０×１０−５ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約３．３×１０−１２Ｍから約４．０×１０−９Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。]
[0021] 本開示の別の態様に従えば、免疫診断試薬は、検出試薬、標準化試薬及び陽性対照試薬からなる群から選択される。]
[0022] 本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合することができる抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）が提供され、前記領域は、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％及び少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープを含む。本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する免疫診断試薬はキメラ抗体を含み、該キメラ抗体は配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合する。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。本開示の別の態様に従えば、これらの抗体を含む免疫診断試薬が提供される。]
[0023] 本開示の別の態様に従えば、抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）並びに前記抗体を含む免疫診断試薬（前記抗体は、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号２８）からなる群から選択されるＶＨ領域を含む。）が提供される。]
[0024] 本開示の別の態様に従えば、抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）並びに前記抗体を含む免疫診断試薬（前記抗体は、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２６）からなる群から選択されるＶＬ領域を含む。）が提供される。]
[0025] 本開示の別の態様に従えば、抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）及び前記抗体を含む免疫診断試薬（前記抗体は、配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のＶＨ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のＶＨ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のＶＨ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のＶＨ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む抗体からなる群から選択される。）が提供される。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。]
[0026] 本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体を発現することができる細胞株が提供され、該細胞株はＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から場合によって選択される。ティー・クルツタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体を発現することができる細胞株も提供され、該細胞株はＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から場合によって選択される。]
[0027] 本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）を場合によって含む免疫診断試薬を感度パネルとして使用することを含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイを標準化する方法が提供される。このようなパネルにおいて、１つ以上の抗体は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡに対して特異的な抗体からなる群から場合によって選択される。]
[0028] 本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を含有すると疑われる試料などの検査試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）を含む免疫診断試薬と接触させることを含むＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の存在を検出する方法が提供される。場合によって、接触は、抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で行われる。さらに場合によって、前記方法は、形成された何れかの抗体：抗原複合体を検出することを含む。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。]
[0029] 本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対する抗体を含有すると疑われる試料などの検査試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体に対して特異的な１つ以上の抗原と接触させることを含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在を検出する方法が提供される。場合によって、この接触は、抗原：抗体複合体の形成を可能とする条件下で行われ、さらに場合によって、前記方法は、抗原：抗体複合体を検出することを含む。さらに、前記方法は、１つ以上の抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）を含む免疫診断試薬を使用することを場合によって含み、抗体の各々は、例えば、陽性対照又は標準化試薬の何れかとして、本方法において使用される抗原の１つを特異的に結合することができる。]
[0030] 本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（組換え及び組換えキメラ抗体を含む。）を含む免疫診断試薬を含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉの検出用診断キットが提供される。このようなキットにおいて、１つ以上の抗体は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡに対して特異的な抗体（キメラ及び組換え抗体）からなる群から場合によって選択される。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。]
[0031] 本開示のさらに別の態様に従えば、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０又はＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部を含む単離されたポリペプチドが提供される。キメラ抗体は、場合によって、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープを特異的に結合するキメラ抗体からなる群から選択される。単離されたポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶＨ領域を場合によって含む。単離されたポリペプチドは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶＬ領域を場合によって含む。さらに、単離されたポリペプチドは、配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域；配列番号１４のＶＨ領域及び配列番号１６のＶＬ領域；配列番号１８のＶＨ領域及び配列番号２０のＶＬ領域；並びに配列番号２８のＶＨ領域及び配列番号２６のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬ領域をともに含む。]
[0032] 本開示のさらに別の態様に従えば、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。キメラ抗体は、場合によって、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープを特異的に結合するキメラ抗体からなる群から選択される。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶＨ領域をコードする領域を場合によって含む。単離されたポリペプチドは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶＬ領域をコードする領域を含む。さらに、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域；配列番号１４のＶＨ領域及び配列番号１６のＶＬ領域；配列番号１８のＶＨ領域及び配列番号２０のＶＬ領域；並びに配列番号２８のＶＨ領域及び配列番号２６のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬ領域をともにコードする領域を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２５及び配列番号２７からなる群から選択されるポリヌクレオチドである。]
[0033] 本開示のさらに別の態様に従えば、抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドを含有すると疑われる試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質に特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ又は組換え抗体を含む。）を含む免疫診断試薬と接触させること、形成された抗体：抗原複合体を単離すること及び抗体から抗原を分離することを含む、配列番号１、３、５又は７に記載されているアミノ酸配列によって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉアミノ酸配列を含む抗原を精製する方法が提供される。場合によって、抗体（キメラ及び組換え抗体）は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドに結合する。]
[0034] 本開示のこれら及び他の特徴、態様、目的及び実施形態は、このような特徴、態様、目的及び実施形態を例示する添付の図面がその中において参照されている以下の詳細な説明においてさらに明らかとなる。]
図面の簡単な説明

[0035] 図１は、本開示のキメラ（マウス−ヒト）抗Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープ抗体の模式的構造を表す。
図２は、プラスミドシャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢｊ、プラスミドサイズ：９５２０ヌクレオチドを模式的に図示している。アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦは、塩基６０−９１７に位置しており、エンハンサーは、塩基１５５１から２０２１に位置しており、プロモーターは、塩基２０２３から２７４４に位置しており、重鎖シグナルペプチドは、塩基２７７２から２８２８に位置しており、ＶＨ遺伝子は、塩基２８２９から３１９４に位置しており、ヒト定常ｈｇＧ１、ｚ、非−ａは、塩基３１９５から４１８７に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基４２１９から４４１３に位置しており、ＳＶ４０プロモーターは、塩基４６８４から５２２９に位置しており、マウスＤＨＦＲは、塩基５２５７から５８２０に位置しており、ＴＫポリＡは、塩基５８４７から６２１３に位置しており、エンハンサーは、塩基６２４１から６７１１に位置しており、プロモーターは、塩基６７１２から７４３３に位置しており、κシグナルペプチドは、塩基７４６０から７５２５に位置しており、ＶＬ遺伝子は、塩基７５２６から７８６１に位置しており、ヒト定常κは、塩基７８６２から８１８５に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基８１９８から８３９２に位置しており、及び、ｐＵＣ起点は、塩基８７５９から９４３２（相補的）に位置しており、
図３ＡからＣは、シャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ中にクローニングされたＶＨ及びＶＬ配列（及び隣接領域）に対する注釈付き注釈付き二本鎖ポリヌクレオチド配列を図示する。図３ＡからＢは、塩基２７７２から２８２８に位置する重鎖シグナルペプチド、塩基２８２９から３１９４に位置するＶＨ遺伝子配列及び塩基３１９５から４１８７に位置するヒト定常ＩｇＧ１、ｚ、非ａ配列に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２１から２２）を図示する。
図３ＡからＣは、シャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ中にクローニングされたＶＨ及びＶＬ配列（及び隣接領域）に対する注釈付き注釈付き二本鎖ポリヌクレオチド配列を図示する。図３ＡからＢは、塩基２７７２から２８２８に位置する重鎖シグナルペプチド、塩基２８２９から３１９４に位置するＶＨ遺伝子配列及び塩基３１９５から４１８７に位置するヒト定常ＩｇＧ１、ｚ、非ａ配列に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２１から２２）を図示する。
図３ＡからＣは、シャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ中にクローニングされたＶＨ及びＶＬ配列（及び隣接領域）に対する注釈付き注釈付き二本鎖ポリヌクレオチド配列を図示する。図３Ｃは、塩基７４６０から７５２５に位置するκシグナルペプチド、塩基７５２６から７８６１に位置するＶＬ遺伝子配列及び塩基７８６２から８１８５に位置するヒト定常κ配列に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２３から２４）を図示する。
図４は、プラスミドシャーガス９−６３８Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢｊ、プラスミドサイズ：９５１４ヌクレオチドを模式的に図示している。アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦは、塩基６０から９１７に位置している；エンハンサーは、塩基１５５１から２０２１に位置しており、プロモーターは、塩基２０２３から２７４４に位置しており、重鎖シグナルペプチドは、塩基２７７２から２８２８に位置しており、ＶＨ遺伝子は、塩基２８２９から３１８８に位置しており、ヒト定常ｈｇＧ１、ｚ、非−ａは、塩基３１８９から４１８１に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基４２１３から４４０７に位置しており、ＳＶ４０プロモーターは、塩基４６７８から５２２３に位置しており、マウスＤＨＦＲは、塩基５２５１から５８１４に位置しており、ＴＫポリＡは、塩基５８４１から６２０７に位置しており、エンハンサーは、塩基６２３５から６７０５に位置しており、プロモーターは、塩基６７０６から７４２７に位置しており、κシグナルペプチドは、塩基７４５４から７５１９に位置しており、ＶＬ遺伝子は、塩基７５２０から７８５８に位置しており、ヒト定常κは、塩基７８５９から８１７９に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基８１９２から８３８６に位置しており、及び、ｐＵＣ起点は、塩基８７５３から９４２６（相補的）に位置している。
図５は、プラスミドシャーガス１０−７４５Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ、プラスミドサイズ：９５１４ヌクレオチドを模式的に図示している。アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦは、塩基６０から９１７に位置している；エンハンサーは、塩基１５５１から２０２１に位置しており、プロモーターは、２０２３から２７４４に位置しており、重鎖シグナルペプチドは、塩基２７７２から２８２８に位置しており、ＶＨ遺伝子は、塩基２８２９から３１８８に位置しており、ヒト定常ＩｇＧ１、ｚ、非−ａは、塩基３１８９から４１８１に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基４２１３から４４０７に位置しており、ＳＶ４０プロモーターは、塩基４６７８から５２２３に位置しており、マウスＤＨＦＲは、塩基５２５１から５８１４に位置しており、ＴＫポリＡは、塩基５８４１から６２０７に位置しており、エンハンサーは、塩基６２３５から６７０５に位置しており、プロモーターは、塩基６７０６から７４２７に位置しており、κシグナルペプチドは、塩基７４５４から７５１９に位置しており、ＶＬ遺伝子は、塩基７５２０から７８５５に位置しており、ヒト定常κは、塩基７８５６から８１７９に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基８１９２から８３８６に位置しており、及び、ｐＵＣ起点は、塩基８７５３から９４２６（相補的）に位置している。] 図１ 図２ 図３Ａ 図３Ｃ 図４ 図５
[0036] 本発明は、とりわけ、トリパノソーマ（スキゾトリパナム）クルーズ抗原を検出又は定量するための方法、アッセイ及びキットを提供する。本開示の一実施形態に従えば、本開示の組換え抗体（キメラ抗体を含む。）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合し、従って、例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉの検出用診断試薬として、及び／又はＴ．ｃｒｕｚｉの検出用アッセイにおける標準化試薬若しくは陽性対照試薬としての使用に適している。]
[0037] 従って、本開示は、各抗体がＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ抗体を含む。）を含む免疫診断試薬も提供する。組換え抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片などであり得る。別の実施形態において、免疫診断試薬は、２つ以上の組換え抗体（キメラ抗体を含む。）を含む。場合によって、免疫診断試薬中で使用される抗体は、免疫診断試薬がＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の複数を検出することができるように、それぞれ、異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質に対して特異的である。場合によって、免疫診断試薬は、シャーガスＦＰ３抗原に対して特異的な組換え抗体、シャーガスＦＰ６抗原に対して特異的な組換え抗体、シャーガスＦＰ１０抗原に対して特異的な組換え抗体及びシャーガスＦＲＡ抗原に対して特異的な組換え抗体からなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して特異的な少なくとも１つ若しくはそれ以上、又は少なくとも２つ若しくはそれ以上の組換え抗体を含む。さらに別の実施形態において、免疫診断試薬の１つ以上の抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって産生される新規モノクローナル抗体であり、シャーガスＦＰ３抗原に対して特異的なモノクローナル抗体、シャーガスＦＰ６抗原に対して特異的なモノクローナル抗体、シャーガスＦＰ１０抗原に対してモノクローナル抗体及びシャーガスＦＲＡ抗原に対してモノクローナル抗体からなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して特異的である。]
[0038] 一実施形態において、本開示は、例えば、ヒト血清に代えて、Ｔ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイ中の標準化試薬として、免疫診断試薬を使用することを提供する。この文脈において、例えば、現行及び将来のＴ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイの性能を評価及び標準化するために、免疫診断試薬を場合によって使用することができる。]
[0039] 本開示のこれらの及びさらなる実施形態、特徴、態様、例示及び実施例が、以下の節にさらに記載されている。本明細書中に別段の定義がなければ、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。]
[0040] Ａ．定義
本明細書に使用されているように、文脈上明確に反対の記述がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数表記が含まれる。本明細書での数的範囲の引用に関して、その間に介在する各数字は、同じ正確度で明示的に想定される。例えば、範囲６から９の場合、６及び９に加えて、数字７及び８が想定され、範囲６．０から７．０の場合、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に想定される。]
[0041] ａ）約
本明細書において使用される「約」という用語は、表記されている値からのおよそ＋／−１０％の変動を表す。このような変動は、具体的に参照されているかどうかに関わらず、本明細書に提供されている何れの所定の値にも常に含まれることを理解すべきである。]
[0042] ｂ）抗体
本明細書において使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、ＴＣＡに対して誘導された単一の抗体（抗ＴＣＡ抗体）、ポリエピトープ特異性を有する抗ＴＣＡ抗体組成物、一本鎖抗ＴＣＡ抗体及び抗ＴＣＡ抗体の断片を含む。「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均質な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する各抗体は、微量に存在する可能性がある天然の変異を除けば同一である。典型的な抗体には、ポリクローナル（ｐＡｂ）、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化、二重特異的（ｂｓＡｂ）、ヘテロ連結物抗体及び二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（Ｒ））及び二重可変ドメイン免疫グロブリンの誘導体（三重可変ドメインなど）が含まれる（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその作製方法は、Ｗｕ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２５（１１）：１２９０−１２９７（２００７）及びＷＯ２００１／０５８９５６（これらの各々の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。）。]
[0043] ｃ）抗体断片
本明細書において使用される「抗体断片」という用語は、完全状態の抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む完全状態の抗体の一部を表し、前記一部は完全状態の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体イソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を含まない。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、軽鎖可変ドメインを１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、重鎖可変領域を１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。]
[0044] ｄ）二重機能性抗体
本明細書において使用される「二重機能性抗体」という用語は、ある抗原性部位に対して特異性を有する第一のアーム及び異なる抗原性部位に対して特異性を有する第二のアームを含む抗体をあらわす。すなわち、二重機能性抗体は二重の特異性を有する。]
[0045] ｅ）生物学的試料
「生物学的試料」という用語には、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体が含まれる。対象から得られる生物学的試料は、ポリペプチド分子を含有する。生物学的試料の例には、全血、血清、血漿、間質液、唾液、眼のレンズ液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹腔液、膣液、月経血、羊水及び精液が含まれる。インビトロ及びインビボで生物学的試料中のＴＣＡを検出するために、検出方法を使用することができる。ＴＣＡを検出するためのインビトロ技術には、酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が含まれる。さらに、ＴＣＡを検出するためのインビボ技術には、標識された抗ＴＣＡ抗体を対象中に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象中でのその存在及び位置を標準的な画像化技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。]
[0046] ｆ）結合定数
本明細書において互換的に使用される「会合速度定数」、「ｋｏｎ」又は「ｋａ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原への抗体の結合速度又は抗体と抗原の間での複合体形成の速度を示す値を表す。]
[0047] 抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）−＞Ａｂ−Ａｇ
本明細書において互換的に使用される「解離速度定数」、「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原からの抗体の解離速度又はＡｂ−Ａｇ複合体が経時的に遊離の抗体及び抗原へ分離することを示す値を表す。]
[0048] Ａｂ＋Ａｇ＜−Ａｂ−Ａｇ
会合及び解離速度定数を測定するための方法は、本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術を用いることによって、平衡状態にある生理的緩衝液中で試料を調べるための高い感度及び能力が得られる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（生物分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチ及び装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢから入手可能な装置、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することが可能である。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイも使用することが可能である。]
[0049] 本明細書において互換的に使用される「平衡解離定数」又は「ＫＤ」という用語は、会合速度（ｋｏｎ）によって解離速度（ｋｏｆｆ）を除することによって得られた値を表す。会合速度、解離速度及び平衡解離定数は、抗原への抗体の結合親和性を表すために使用される。]
[0050] ｇ）キメラ抗体
本明細書において使用される「キメラ抗体」（又は「ｃＡｂ」）という用語は、別の宿主種由来の抗体定常領域の少なくとも一部に連結されたある宿主種由来の抗体の重及び軽鎖可変領域の全部又は一部を含むポリペプチドを表す。]
[0051] ｈ）対応している又は対応する
「対応している」又は「対応する」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の全部又は一部と同一であることを表す。「〜に相補的」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の相補的な鎖の全部又は一部と同一であることを表すために、本明細書において使用される。例として、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。]
[0052] 本明細書において別段の記載がなければ、全ての核酸配列は５’から３’の方向に書かれており、全てのアミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書かれている。]
[0053] ｉ）誘導化された抗体
本明細書において使用される「誘導化された抗体」という用語は、別の機能的分子に誘導化された又は連結された抗体又は抗体の一部を表す。例えば、抗体又は抗体断片は、化学的カップリング、遺伝的融合又は非共有会合などによって、別の抗体、検出可能な因子、細胞毒性因子、薬剤及び抗体又は抗体の一部の別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介することができるポリペプチドなどの１つ以上の分子に機能的に連結され得る。誘導化された抗体の１つの種類は、２つ以上の抗体を架橋することによって産生される。適切な架橋剤には、ヘテロ二機能性（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二機能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）であるものが含まれる。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手することができる。]
[0054] ｊ）検出可能な標識
本明細書において使用される「検出可能な標識」という用語には、直接又は間接的に検出することが可能な分子又は部分が含まれる。さらに、これらの因子は抗体で誘導化することが可能であり、蛍光性化合物が含まれる。標識のクラスには、蛍光性、発光性、生物発光性及び放射性物質、酵素及び補欠分子族が含まれる。有用な標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エコーリン及び１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが含まれる。]
[0055] ｋ）診断的に適切な
Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の領域に関して本明細書において使用される「診断的に適切な」という用語は、その検出が、単独で又はシャーガスの他の診断的に適切な領域と組み合わせて、Ｔ．ｃｒｕｚｉの検出を可能とするタンパク質の領域を表す。診断的に適切な領域の例には、本分野において公知の免疫優性領域及び本明細書に記載されているような領域が含まれる。]
[0056] ｌ）エピトープ又は目的のエピトープ
本明細書において使用される「エピトープ」又は「目的のエピトープ」という用語は、認識され及びその特異的な結合対上の相補的部位に結合することができる何れかの分子上の部位を表す。分子及び特異的結合対は、特異的結合対の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原（糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖など（但し、これらに限定されない。））又は多糖であり得、その特異的結合対は抗体であり得る（但し、これらに限定されない。）。典型的には、エピトープは、より大きな抗原性断片（すなわち、抗体を結合することができる領域又は断片）内に含有され、特異的結合対に接触することが知られている正確な残基を表す。抗原性断片は２以上のエピトープを含有することが可能である。]
[0057] ｍ）ヒト化抗体
本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、可変領域の一部が非ヒト種由来の対応する配列によって可変領域の一部が置換されており及び修飾された可変領域がヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結されている、ヒト抗体の修飾された可変領域を含むポリペプチドを表す。一実施形態において、可変領域の一部は相補性決定領域（ＣＤＲ）の全部又は一部である。この用語は、ハイブリッド抗体が所望の生物活性（すなわち、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合する能力）を示す限り、起源となる種、タンパク質の種類、免疫グロブリンクラス又はサブクラスの指定に関わらず、非ヒト抗体の可変領域又は１つ若しくはそれ以上のＣＤＲを異種タンパク質とスプライシングすることによって産生されたハイブリッド抗体も含まれる。]
[0058] ｎ）単離された又は精製された
「単離された」又は「精製された」という用語は、分子を参照する場合、同定されており、その天然環境の成分から分離及び／又は回収されている分子を表す。その天然環境のきょう雑成分は、診断又は治療的使用を妨害する物質である。「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又は本明細書において使用されている生物学的に活性な断片（Ｆａｂ断片など）は、その環境の成分から分離及び／又は回収されているポリペプチド又は生物学的に活性な断片を表す。きょう雑成分には、ポリペプチドに関する診断的使用を通例妨害する物質が含まれ、酵素、ホルモン及び他のポリペプチド性又は非ポリペプチド性物質が含まれ得る。実質的に単離するために、調製物は、きょう雑物質の乾燥重量の約３０％未満（すなわち、約０．０１％から約３０％）、通常、約２０％未満（すなわち、約０．０１％から約２０％）、約１０％未満（すなわち、約０．０１％から約１０％）、より頻繁には、約５％未満（すなわち、約０．０１％から約５％）のきょう雑物質を有する。単離され、組換え的に産生されたＴＣＡ、ＶＬ若しくはＶＨ又は生物学的に活性な部分は、望ましくは、培地を実質的に含まない。すなわち、培地は、ＴＣＡ、ＶＬ又はＶＨ調製物の容量の約２０％、約１０％又は約５％未満を占める。従って、本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を表す。しかしながら、Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープを特異的に結合する単離された抗体は、例えば、シャーガスポリペプチドＴｃｆ及びＦＰ６上に見出されるＰｅｐ２エピトープを結合する抗体など、他のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対する交叉反応性を有することができる。]
[0059] ｏ）品質管理試薬
本明細書において記載されるように、イムノアッセイは、例えば、較正用物質、対照及び感度パネルを含む（但し、これらに限定されない。）「品質管理試薬」を取り込む。「較正用物質」又は「標準」は、抗体濃度を内挿するための較正（標準）曲線を確立するために、通例使用される（例えば、１つ以上又は種々の）場合によって、正／負のカットオフに近い単一の較正用物質を使用することができる。「感度」パネルを構成するために、複数の較正用物質（すなわち、２以上の較正用物質又は較正用物質の変動量）を合わせて使用することができる。「陽性対照」はアッセイ性能特性を確立するために使用され、試薬（例えば、抗原）の完全性の有用な指標である。]
[0060] ｐ）組換え抗体
本明細書において使用される「組換え抗体」という用語は、組換え技術によって、１つ以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を適切な発現ベクター中にクローニングし、続いて、適切な宿主細胞中で抗体を発現させることを含む１つ以上の工程によって調製された抗体を表す。従って、この用語には、モノクローナル抗体である組換え的に作製された抗体、モノクローナル抗体の断片を含む抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全又は部分的にヒト化）、抗体断片から形成された多重特異的又は多価構造（二重可変ドメイン免疫グロブリン、ＤＶＤ−Ｉｇ（Ｒ）と名付けられた四価ＩｇＧ様分子を含む。）及び二重機能性抗体が含まれるが、これらに限定されない。]
[0061] ｑ）特異的な又は特異性
本明細書において使用される、特異的な結合対（例えば、抗原及び抗体）の要素間での相互作用に関する「特異的な」又は「特異性」は、相互作用の選択的反応性を表す。「〜に特異的に結合する」という用語及びその類似語は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質に特異的に結合し、他の物体には特異的に結合しない抗体の能力を表す。Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片は、例えば、診断用イムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）及び酵素連結免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）（例えば、Ｐａｕｌ， ｅｄ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３３２−３３６ （１９８９）参照）、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）、ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能）又は当業者に公知の他の技術によって同定され得る。]
[0062] ｒ）実質的に同一の
核酸又はアミノ酸配列に関して本明細書で使用される「実質的に同一の」という用語は、例えば、以下に記載されている方法を用いて、最適に並置された場合に、その核酸又はアミノ酸配列が所定の別の核酸又はアミノ酸配列（又は「参照配列」）と少なくとも約７０％（例えば、約７０％から約１００％）、少なくとも約７５％（例えば、約７５％から約１００％）、少なくとも約８０％（例えば、約８０％から約１００％）、少なくとも約８５％（例えば、約８５％から約１００％）、少なくとも約９０％（例えば、約９０％から約１００％）、少なくとも約９５％（例えば、約９５％から約１００％）、少なくとも約９６％（例えば、約９６％から約１００％）、少なくとも約９７％（例えば、約９７％から約１００％）、少なくとも約９８％（例えば、約９８％から約１００％）又は少なくとも約９９％（例えば、約９９％から約１００％）の配列同一性を有することを表す。「実質的な同一性」は、完全長配列、エピトープ又は免疫原性ペプチド、機能的ドメイン、コード及び／又は制御配列、エキソン、イントロン、プロモーター及びゲノム配列など、配列の様々な種類及び長さを表すために使用することができる。２つのアミノ酸又は核酸配列間の％同一性は、当業者の技術水準の範囲に属する様々な方法で、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ， Ｔ． Ｆ． ａｎｄ Ｍ． Ｓ． Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１） Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ １４７：１９５−７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ ＰｌｕｓＴＭに取り込まれているような“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１））、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ． Ｏ．， Ｅｄ ｐｐ３５３−３５８；ＢＬＡＳＴｐｒｏｇｒａｍ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ， ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３−１０）並びにＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ及びＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどのこれらの変形などの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて測定することができる。さらに、当業者は、比較されている配列の長さにわたって最大の並置を達成するために必要とされるアルゴリズムなど、並置を測定するための適切なパラメータを決定することが可能である。一般に、アミノ酸配列に関して、比較配列の長さは少なくとも約１０アミノ酸である。当業者は、実際の長さが比較されている配列の全長に依存すること、及び少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００若しくは少なくとも約３５０アミノ酸であり得、又はアミノ酸配列の完全長であり得ることを理解する。核酸の場合、比較配列の長さは、一般に、少なくとも約２５ヌクレオチドであるが、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００若しくは少なくとも約１０００であり得、又は核酸配列の完全長であり得る。]
[0063] ｓ）表面プラズモン共鳴
本明細書において使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ａ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｌｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｅｎｓｏｒｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−７７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｅｎｓｏｒ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−３１； Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｎｎ Ｂｉｏｌ ＣＵｎ （Ｐａｒｉｓ）５１：１９−２６）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイム二重特異的相互作用の分析を可能とする光学的現象を表す。]
[0064] ｔ）ＴＣＡ
本明細書で使用される「ＴＣＡ」という略号は、「Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原」を意味する。ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＴｃＦ、ＦＰ６及びＦＰ１０はＴＣＡを表し、以下でさらに定義されている。他の略号は導入されるごとに定義されている。]
[0065] 本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載することを目的とするものであり、その他の限定を意図するものではない。]
[0066] Ｂ．抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体及び該抗体を産生する細胞株
本開示は、とりわけ、新規抗体、これらの抗体を産生する細胞株及びこれらの抗体を作製する方法を提供する。これらの抗体は、様々なＴ．ｃｒｕｚｉ抗原（ＴＣＡ）を結合し、ＦＰ３、Ｐｅｐ２（ＴｃＦ、ＦＰ６）及びＦＰ１０ポリペプチド中に含有されているものが含まれ、マウスｍＡｂ、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＣＤＶＤ−Ｉｇ（Ｒ））などのｍＡｂとして、又はマウス−ヒト（Ｍｕ−Ｈｕ）キメラなどのキメラ抗体として使用することができる。これらの抗体は、イムノアッセイ中の陽性対照として有用である。さらに、抗体は、ＴＣＡを保有するＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドを精製するために使用することができる。本開示の抗体及び細胞株の例が、以下の表１に挙げられている。]
[0067] ]
[0068] 本開示の抗体のさらなる例は、
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合し（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体は、約７．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約７．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約４．０×１０−３ｓ−１から約３．０×１０−１ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約５．７×１０−１０Ｍから約４．３×１０−７Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体は、約１．０×１０６Ｍ−１ｓ−１から約８．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約６．０×１０−３ｓ−１から約４．０×１０−２ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約７．５×１０−１０Ｍから約４．０×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体は、（ａ）約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１から約３．０×１０５Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、（ｂ）約１．０×１０−４ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び（ｃ）約３．３×１０−１０Ｍから約１．６×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体は、約２．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約６．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約２．０×１０−５ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約３．３×１０−１２Ｍから約４．０×１０−９Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。]
[0069] 本明細書中でさらに記載されているような抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体及びこれらの抗体を産生する細胞株を作製するために、一般に、２工程のプロセスを経た。（１）目的の抗原（Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープ（ＴＣＡ））に特異的に結合されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が開発され、及び（２）組換え技術を用いて、キメラ抗体を改変し、次いで、改変された抗体を産生させるために、哺乳動物の発現細胞株を使用した。この第二の部分において、所望のｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞株を同定した後、ｍＲＮＡをこれらの細胞から単離し、抗体遺伝子配列を同定した。次いで、（ヒト抗体配列を供給する）ｐＢＯＳベクター中に可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）ポリヌクレオチド配列をクローニングし、次いで、得られたキメラ抗体が機能的であることを確認するために、一過性発現系中にｐＢＯＳベクターを同時形質移入した。確認したら、ＶＬ配列をｐＪＶプラスミド中に、及びＶＨ配列をｐＢＶプラスミド中にサブクローニングした。これらのベクターは、次いで、安定なｐＢＪ発現ベクターを構築するために使用した。次いで、ｐＢＪでＣＨＯ細胞を形質移入し、形質移入体を選択し、分泌された抗体を再度検査し、産業規模の製造を可能とする。従って、本開示のキメラ抗体の典型を作製するために、マウスＶＨ及びＶＬ領域をヒト定常鎖（ＣＨ）及び定常軽鎖（ＣＬ）領域と組み合わせた。従って、キメラ抗体は、ＴＣＡに対するマウスｍＡｂ機能的特異性及び親和性を保持しているが、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）を検出するために設計された抗体アッセイにおいて反応する。一実施形態において、本開示は、ＴＣＡＦＰ３、Ｐｅｐ２（ＦＰ６／Ｔｃｆ）、ＦＰ１０及びＦＲＡを特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に関する。ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０又はＦＲＡ組換え抗原を用いて、マウスを個別に免疫化し、抗体産生マウスを同定し、安楽死させ、脾細胞を採集し、骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞株を産生するｍＡｂを単離する。]
[0070] Ｃ．免疫診断用試薬
本開示の免疫診断用試薬は、本明細書に記載されている１つ以上の抗体を含む（例えば、本明細書中のＢ及びＥ節を参照。）。例えば、免疫診断用試薬を含む抗体には、組換え抗体が含まれ得、ここでも、組換え抗体にはＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する組換えキメラ抗体が含まれる。従って、一実施形態において、本開示によって提供される免疫診断用試薬は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる単一の抗体を含む。別の実施形態において、本開示によって提供される免疫診断用試薬は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる単一のキメラ抗体を含む。他の実施形態において、免疫診断用試薬は、各々がＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域（例えば、同じ領域又は異なる領域）を特異的に結合することができる１つ以上の組換え抗体（組換えキメラ抗体など）を含み得る複数の抗体を含む。複数のキメラ抗体の１つ以上は、同じＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することが可能であり得る。あるいは、キメラ抗体の複数の各々は、異なるＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる。]
[0071] 本開示の一実施形態において、免疫診断用試薬は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の複数を検出することが可能であり、各々が異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合することができる２つ以上の組換え抗体を場合によって含む。さらなる実施形態において、免疫診断用試薬は、各々が異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合することができる３つ以上の組換え抗体を場合によって含む。別の実施形態において、免疫診断用試薬は、各々が異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合することができる４つ以上の組換え抗体を場合によって含む。]
[0072] 免疫診断用試薬によって含まれる組換え抗体は、例えば、検出目的のために、固体支持体上への固定化のために、安定性を改善するために及び／若しくは薬物動態学的特性を改善するために、又は本分野において公知である他の手段によって場合によって修飾され得る。]
[0073] Ｄ．Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原
Ｔ．ｃｒｕｚｉは、複雑な生活環を有する複雑な生物である。しかしながら、寄生生物の診断的検出のために有用である重要な抗原が同定されている。]
[0074] ＦＰ３抗原（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ． Ｖ．， ａｎｄ Ｋ． Ｏｔｓｕ．米国特許出願２００４／０１３２０７７号。２００４）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉＡｇ１５（Ｏｔｓｕ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １４−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｅａｔｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５７：３１７−３０）とＴ．ｃｒｕｚｉプロテインＣ（後者は、鞭毛カルシウム結合タンパク質（Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９８５．Ａｐｐａｒｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄｍＲＮＡｆｒｏｍ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：５７８９−８０４）の組み合わせに実質的に対応する組換えタンパク質である。ポリヌクレオチド配列（配列番号１）及びポリペプチド配列（配列番号２）は、それぞれ、下表２及び３に示されている。Ｔ．ｃｒｕｚｉの１４アミノ酸反復に対して特異的なアミノ酸配列は表３において下線が付されており、Ｔ．ｃｒｕｚｉのプロテインＡに対応するアミノ酸は表３において太字で記載されており、プロテインＢに対応するアミノ酸は表３において斜字体で記載されており、プロテインＣに対応するアミノ酸は表３において二重下線が付されている。]
[0075] ]
[0076] ]
[0077] Ｐｅｐ２抗原（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ及びＯｔｓｕ，２００４）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＰ６及びＴｃｆ、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチド（何れも、Ｐｅｐ２抗原を有する。）の反復配列の組換えタンパク質である。ポリヌクレオチド配列（配列番号３）及びポリペプチド配列（配列番号４）が、それぞれ、表４及び５に示されている。]
[0078] ]
[0079] ]
[0080] ＦＰ１０抗原（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ａｎｄ Ｏｔｓｕ， ２００４）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉの反復配列の別の組換えタンパク質である。そのポリヌクレオチド（配列番号５）及びポリペプチド（配列番号６）配列は、それぞれ、下表６及び７に示されている。Ｉ−ドメインのアミノ酸配列は表７中において下線が付されており、Ｊ−ドメインのアミノ酸配列は、表７中において斜字体で記載されており、Ｋ−ドメインのアミノ酸配列は、表７中において太字で記載されており、Ｌ−ドメインのアミノ酸配列は表７中において二重下線が付されている。]
[0081] ]
[0082] ]
[0083] ＦＲＡ抗原は、鞭毛反復タンパク質配列であり（Ｌａｆａｉｌｌｅ， ＪＪ．， ｅｔｃ．１９８９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３５：１２７−３６）、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｊ０４０１５、下表８（ポリヌクレオチド配列、配列番号７）及び９（ポリペプチド配列；配列番号８）に示されている。]
[0084] ]
[0085] ]
[0086] 配列番号２、４、６及び８のＴＣＡは、インビトロで合成することが可能であり、又はポリヌクレオチド配列（配列番号１、３、５及び７と実質的に類似するものなど）から組換え的に発現することが可能である。遺伝子コードの縮重並びに配列番号２、４、６及び８のポリペプチドが置換を許容する能力のために、本開示を実施するために、配列は同一である必要はない。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の同一性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％及び、もちろん、約１００％など、約７０％から約１００％（特に、約９０％から約９７％）の範囲であり得る。]
[0087] ＴＣＡは、ポリペプチド化学を用いて、インビトロで容易に合成することができる。例えば、ポリペプチド合成は、Ｒａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ， Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒなどの自動化されたポリペプチド合成装置を用いて、固相支持体上に、段階的様式で実施することができる。ペプチド合成装置は、固相ペプチド合成を実施するために、Ｆｍｏｃ化学をＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化と組み合わせる。]
[0088] 合成は、Ｃ末端アミノ酸から始まり、カルボキシ末端は不溶性のポリマー支持体樹脂に共有結合される。有用な樹脂は、樹脂１ｇ当りＣ末端アミノ酸０．１ｍｍｏｌから０．７ｍｍｏｌを搭載することができる。ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＭＡ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ−ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）又は水など、典型的な合成サイクルの間に使用される様々な溶媒及び化学物質に対して耐性を示し、連続的なフロー又はバッチ合成用途に適し得る。有用な樹脂の例には、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（ＨＭＰ樹脂）、ＰＥＧｃｏ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、ＮｏｖａＳｙｎＴＧＡ（Ｒ）樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂及びＣＬＥＡＲアミド樹脂が含まれる。アミノ酸が結合された樹脂は多数の様々な入手先から市販されているが、このような結合された樹脂は実験室において調製することもできる。]
[0089] 樹脂に結合されたアミノ酸（又はポリペプチド）のＮ末端は、次のＮ−末端アミノ酸反応物質の添加前に除去される９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によって化学的に保護される。Ｆｍｏｃ基は、ＮＭＰ又はＤＭＦなどの適切な溶媒中のアミン（２０から５５％ピペリジンなどの）の濃溶液によって容易に除去される塩基に対して不安定な保護基である。Ｆｍｏｃ脱保護のための他の有用なアミンには、トリス（２−アミノエチル）アミン、４−（アミノメチル）ピペリジン、テトラブチルアンモニウムフルオリド及び１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）が含まれる。樹脂に結合された全てのポリペプチド鎖が各カップリングサイクルに有効に関与するように、Ｎ末端からＦｍｏｃ基を完全に除去することが重要であり、そうでないと、異なる長さ及び配列のポリペプチド鎖が得られる。Ｆｍｏｃ基の塩基触媒による除去の後、塩基触媒を除去するために、適切な緩衝液で樹脂を徹底的に洗浄する。]
[0090] 多くのアミノ酸の側鎖は、アミン、アルコール又はチオールなどの化学的に反応性を有する基を含有する。これらの側鎖は、カップリング工程の間に、所望されない副反応を防止するためにさらに保護しなければならない。塩基に対して安定である、より好ましくは、塩基に対して安定であり且つ酸に対して不安定である側鎖保護基が最も有用である。表１０は、アミノ酸のこのカテゴリーに関する側鎖保護基の典型的な群を記載する。]
[0091] ]
[0092] 導入されるＦｍｏｃ保護されたアミノ酸のカルボキシル基は、樹脂に結合されたポリペプチドのＮ末端への効率的な化学的連結を達成するために活性化される。活性化は、反応性エステルを生成するためにＦｍｏｃ保護されたアミノ酸を適切な試薬と反応させることによって典型的に達成される。活性化されたエステルの例には、ペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル及び３−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−４−オキソ−ベンゾ−トリアゾン（ＯＤｈｂｔ）エステル、ＯＢｔエステル及び１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）から誘導されるＯＡｔエステルが含まれる。カップリング反応は、ＤＣＣ、ＢＯＰ、ＢＯＰ−Ｃｌ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ又はＯ−（７−アザベンゾトリゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＡＴＵ）などの活性化試薬を用いて、原位置で行うことができる。典型的なカップリング反応には、ＨＯＢｔ及びＨＢＴＵの混合物又はＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ及びＤＩＥＡの混合物が含まれた。Ｎ−メチルアミノ酸に関して、カップリング条件は唯一のカップリング試薬としてブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒｏＰ）を使用することが可能であり、カップリング反応は、Ｎ２下に存在するＤＩＥＡとともにＤＣＭ中において手動で実施される。Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸は、樹脂に連結されたポリペプチドに対してモル濃度過剰で存在する。遅い速度で進行するカップリング反応に関しては、樹脂に結合された全てのポリペプチドが活性化されたＦｍｏｃアミノ酸と確実に首尾よく付加反応を行うようにするために、カップリング反応は１回以上（二重又は多重カップリング）繰り返される。不完全なカップリング反応に関しては、全ての反応していないＮ末端残基は、適切なキャッピング試薬を用いてキャップされる。]
[0093] カップリング反応後、反応していないＦｍｏｃアミノ酸及びカップリング試薬を除去するために、樹脂支持体は洗浄される。次いで、別のアミノ酸を付加するためのポリペプチドを調製するために、樹脂はＮ末端のＦｍｏｃ基の塩基触媒された除去の新しいサイクルに供される。所望のポリペプチドが合成された後、残存するＦｍｏｃ保護基の塩基触媒された除去に樹脂を供する。塩基を除去するために、ポリペプチドが結合された樹脂を洗浄し、あらゆるアミノ酸側鎖保護基を除去するために、及び樹脂支持体からポリペプチド鎖を放出するために、続いて、酸で処理する。有用な酸は、試薬Ｋ［ＴＦＡ：チオアニソール：エタンジチオール：フェノール：水（８２．５：５：２．５：５：５）］などの適切なスカベンジャーの存在下にあるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸である。]
[0094] 続いて、ろ過によって、樹脂からポリペプチドを分離し、ＤＣＭ／ＤＭＦなどの適切な溶媒で場合によって繰り返し洗浄する。適切な分子量カットオフを有する膜を使用する限外ろ過を通じて、場合によってポリペプチドを脱塩することができる。ポリペプチドは、冷メチルｔ−ブチルエーテル又はｔ−ブチルエチルエーテルなどの適切な溶媒を用いて、溶液から沈殿させることが可能であり、沈殿は、冷エーテルなどの適切な溶媒で場合によって洗浄され、乾燥される。Ｃ１８樹脂を用いる疎水性クロマトグラフィー及びＴＦＡ／水／アセトニトリルなどの適切なクロマトグラフィー緩衝系などの適切なクロマトグラフィー手段を用いて、ポリペプチドをさらに精製することができる。ペプチドの純度は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析又は配列決定などの質量分析によって、場合によって分析することができる。]
[0095] あるいは、配列番号２、４、６及び８のＴＣＡは、例えば、発現ベクターを用いて、配列番号１、３、５及び７のポリヌクレオチド配列を用いて組換え的に発現させることができる。発現ベクター中で、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡを転写するために、宿主細胞へシグナルを伝達する要素（プロモーターなど）に作用可能に連結される。特定の因子に応答して遺伝子転写を調節する誘導性プロモーターなど、幾つかのプロモーターは極めて有用である。誘導性プロモーターの例には、ある種の細胞種に発現を限定する組織特異的なプロモーター、ステロイド応答性の（例えば、グルココルチコイド）プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ， ＲＪ．１９９０．Ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１）及びテトラサイクリン又は熱ショック反応性のプロモーターが含まれる。ｌａｃオペロンなどの幾つかの細菌性抑制系は、哺乳動物細胞及びトランスジェニック動物中で活用することが可能である（Ｆｉｅｃｋ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１７８５−９１；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ， Ｄ．Ｌ．， Ｌ．Ｃ． ＤｕＣｏｅｕｒ， ａｎｄ Ｊ．Ｍ． Ｓｈｏｒｔ．１９９６）。Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ．２８：４４７−５８； Ｗｙｂｏｒｓｋｉ， Ｄ． Ｌ．， ａｎｄ Ｊ．Ｍ． Ｓｈｏｒｔ．１９９１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ ．ｃｏｌｉ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−５３）。組換え核酸技術、細胞中への形質移入並びに細胞及びインビトロでの発現は、以下でさらに論述されている。]
[0096] Ｅ．組換え抗体
本開示の組換え抗体は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質に特異的に結合することができる固有の抗体のＶＨ及び／又はＶＬドメインに由来する抗原結合領域を含む。組換え抗体は、例えば、組換え的に産生されるモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異的、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（Ｒ））又は抗体断片から形成された多価構造又は二重機能的抗体であり得る。]
[0097] 一実施形態において、場合によって、組換え抗体は、
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体が約７．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約７．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約４．０×１０−３ｓ−１から約３．０×１０−１ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約５．７×１０−１０Ｍから約４．３×１０−７Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体が約１．０×１０６Ｍ−１ｓ−１から約８．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約６．０×１０−３ｓ−１から約４．０×１０−２ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約７．５×１０−１０Ｍから約４．０×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体が（ａ）約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１から約３．０×１０５Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、（ｂ）約１．０×１０−４ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び（ｃ）約３．３×１０−１０Ｍから約１．６×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体が約２．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約６．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約２．０×１０−５ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約３．３×１０−１２Ｍから約４．０×１０−９Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。別の実施形態において、場合によって、組換え抗体は、マウスモノクローナル抗体の特異性及び親和性を保持し、並びにヒト免疫グロブリンを測定するイムノアッセイフォーマットにおいて反応するキメラ抗体である。場合によって、マウス−ヒトキメラ抗体は、ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０又はＦＲＡ抗原に対して誘導される。場合によって、このようなキメラ抗体は、Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）及びＰＲＩＳＭ（Ｒ）プラットフォームなどの（但し、これらに限定されない。）既存のイムノアッセイフォーマットにおいて反応する。]
[0098] 組換え抗体によって含まれる抗原結合領域は、固有抗体由来のＶＨ及び／若しくはＶＬ配列を含むことができ、又は１つ若しくはそれ以上の他の抗体に由来する配列とともに、抗体の１つ若しくはそれ以上の部分（ＣＤＲなど）を含むことができる。一実施形態において、組換え抗体は固有抗体の完全長ＶＨ及びＶＬ配列を含む。]
[0099] 抗原結合領域が由来する固有抗体は、一般に、脊椎動物の抗体にである。例えば、固有抗体は、げっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラット）抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウシ抗体、ウマ抗体、ブタ抗体、類人猿（例えば、チンパンジー）抗体又はヒト抗体であり得る。抗体源は、主として、便利さを基本とする。一実施形態において、固有抗体は非ヒト抗体である。]
[0100] 組換え抗体は、同じ固有抗体又は異なる抗体に由来する１つ以上の定常領域（例えば、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＨ４領域）を含むこともできる。定常領域は、上に列記されている種などの（但し、これらに限定されない。）多数の脊椎動物種の１つから得られる抗体に由来し得る。本開示の一実施形態において、組換え抗体は少なくとも１つの定常領域を含む。別の実施形態において、組換え抗体はヒト抗体に由来する１つ以上の定常領域を含む。本開示の特定の実施形態において、組換え抗体は、ヒト抗体の定常領域に連結された非ヒト抗体の可変領域を含む。]
[0101] 組換え抗体を構成する定常領域は、例えば、ヒト免疫グロブリン由来の定常領域に対する１つ以上の免疫グロブリンクラス又はイソタイプに由来し得、定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２又はＩｇＥ定常領域の１つ以上に由来し得る。定常領域がＩｇＧ軽鎖に由来する領域を含む場合、これは、κ鎖又はλ鎖に由来し得る。組換え抗体は、２以上のクラス又はイソタイプから得られる配列を含み得る。組換え抗体の所望の機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、本分野における通常の技術水準に属する。本開示の一実施形態において、組換え抗体はＩｇＧに由来する１つ以上の定常ドメインを含む。別の実施形態において、組換え抗体はＩｇＧ定常領域の重及び軽鎖の両方から得られる領域を含む。]
[0102] 本開示の一実施形態において、抗原結合領域は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質の診断的に適切な領域内のエピトープに特異的に結合する固有抗体に由来する。]
[0103] 本開示の特定の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２６又は２８の何れか１つに記載されているＶＨ又はＶＬ配列の全部又は一部と実質的に同一なアミノ酸配列を含む（下表１２参照。配列番号識別子のまとめ及び対応する配列の説明については、下表１１参照。）。別の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、ＶＨ又はＶＬ配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。]
[0104] ]
[0105] ]
[0106] 本開示の一実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２５又は２７のいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列の全部又は一部と実質的に同一のアミノ酸配列を含む（下表１３参照）。別の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、ＶＨ又はＶＬ配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号９及び１１の１つ若しくはそれ以上、配列番号１３及び１５の１つ若しくはそれ以上、配列番号１７及び１９の１つ若しくはそれ以上、又は配列番号２５若しくは２７の１つ若しくはそれ以上によってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む（下表１３参照）。]
[0107] 本開示の別の特定の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２５又は２７の何れか１つによって記載される配列の全部又は一部と実質的に同一の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。]
[0108] ]
[0109] 組換え抗体のアミノ酸配列は、親配列に正確に対応する必要はない。すなわち、組換え抗体のアミノ酸配列は、「変形配列」であり得る。例えば、組換え抗体によって含まれるドメインに応じて、その部位の残基が何れかの親（又は参照）配列に対応しないように、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４の１つ以上は、適宜、１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によって変異を受け得る。しかしながら、当業者は、このような変異は大規模なものではなく、組換え抗体のその標的ＴＣＡへの結合に著しい影響を及ぼさないことを理解する。本開示に従えば、組換え抗体が変形配列を含む場合、変形配列は、参照配列と少なくとも約７０％（例えば、約７０％から約１００％）と同一である。一実施形態において、変形配列は、参照配列と少なくとも約７５％（例えば、約７５％から約１００％）と同一である。他の実施形態において、変形配列は、参照配列と少なくとも約８０％（例えば、約８０％から約１００％）、少なくとも約８５％（例えば、約８５％から約１００％）又は少なくとも約９０％（例えば、約９０％から約１００％）同一である。特定の実施形態において、参照配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２６又は２８の何れか１つに記載されている配列に対応する。]
[0110] 一般に、組換え抗体が１つ以上のアミノ酸置換を含有する変形配列を含む場合、アミノ酸置換は「保存的置換」である。保存的置換は、類似の側鎖特性を有する別の残基によってあるアミノ酸残基を置換することを含む。本分野において知られているように、天然に存在する２０のアミノ酸は、その側鎖の物理化学的特性に従ってグループ分けすることができる。適切なグループ分けには、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン（極性非帯電側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）並びにリジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）が含まれる。アミノ酸の別のグループ分けは、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、同じ群から得られる別のアミノ酸によって、あるアミノ酸を置換することを含む。]
[0111] 従って、他の実施形態における本開示は、本明細書に開示されている新規組換え抗体配列に対応する単離されたポリペプチドをさらに提供する。場合によって、単離されたポリペプチドは、ＦＰ３、ＦＰ６及びＦＰ１０からなる群から選択されるＴＣＡの診断的に適切な領域に特異的に結合する組換え（例えば、キメラ）抗体の部分を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２、１６、２０又は２８の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、相補性決定領域配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０、１４、１８又は２６の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、相補性決定領域配列を含むＶＬ領域を含む。]
[0112] さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１１、１５、１９又は２７の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号９、１３、１７又は２５の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含む。]
[0113] 同様に、可変領域をコードする核酸配列は、親参照配列に正確に対応する必要はないが、遺伝コードの縮重によって及び／又は上記変形アミノ酸配列をコードするように変動し得る。従って、本開示の一実施形態において、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７０％（例えば、約７０％から約１００％）同一である。別の実施形態において、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７５％（例えば、約７５％から約１００％）同一である。他の実施形態において、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約８０％（例えば、約８０％から約１００％）、少なくとも約８５％（例えば、約８５％から約１００％）又は少なくとも約９０％（例えば、約９０％から約１００％）同一である。特定の実施形態において、参照配列は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２５又は２７の何れか１つに記載されている配列に対応する。]
[0114] 従って、他の実施形態における本開示は、本明細書に開示されている新規組換え抗体配列（キメラ抗体配列を含む。）をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。場合によって、単離されたポリヌクレオチドは、ＦＰ３、ＦＰ６及びＦＰ１０からなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する組換え（例えば、キメラ）抗体の一部をコードする。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、１６、２０又は２８の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域をコードする。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０、１４、１８又は２６の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ領域をコードする。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、相補性決定領域配列を含むＶＬ領域をコードする。]
[0115] さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９、１３、１７又は２７の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域をコードする。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、相補性決定領域配列を含むＶＨ領域をコードする。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１、１３、１９又は２５の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域をコードする。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、相補性決定領域配列を含むＶＬ領域をコードする。]
[0116] 一実施形態において、抗体は、ヒト免疫系に曝露された場合に、抗体の免疫原性を除去又は低減するために、ヒトＴ細胞に対する潜在的エピトープである抗体の非ヒト部分中の１つ以上のアミノ酸を変異させることによって固有抗体に比べて、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにさらに修飾することができる。適切な変異には、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び挿入が含まれる。]
[0117] 一実施形態において、本開示の組換え抗体は、適切な固相上に固定化するためにさらに修飾することができる。固定化は、固相への共有又は非共有的（例えば、イオン性、疎水性など）を通じて達成することができる。適切な修飾は本分野において公知であり、固体支持体への組換え抗体の架橋又は付着を促進するために、組換え抗体によって含まれるアミノ酸配列の１つのＣ末端又はＮ末端の何れかに官能基又は化学的部分を付加することが含まれる。典型的な修飾には、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）若しくはＳ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）などの官能基の付加又はアミノ酸配列のＮ若しくはＣ末端への１つ若しくはそれ以上のシステイン残基の付加が含まれる。他の架橋試薬が本分野において公知であり、多くは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡのカタログ参照）。例には、１，６−ジアミノヘキサンなどのジアミン；グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド、エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）などのビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ジスクシンイミジルグルタラート、ジスクシンイミジルスベラート及びエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシナート）；ヘキサメチレンジイソシアナートなどのジイソシアナート；１，４−ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン；スクシニジサリチラートなどの二カルボン酸；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが含まれるが、これらに限定されない。]
[0118] 他の修飾には、Ｎｉ２＋誘導化表面への結合を可能とするためのヒスチジン残基又はジスルフィド架橋形成若しくはＳＵＬＦＯＬＩＮＫＴＭアガロースへの結合を可能とするためのシステイン残基など、Ｎ又はＣ末端への１つ以上のアミノ酸の付加が含まれる。あるいは、固体支持体から組換え抗体を最適に離すために、Ｎ末端又はＣ末端に１つ以上の化学的スペーサーを含むように、抗体を修飾することができる。使用可能なスペーサーには、６−アミノヘキサン酸、１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノエタン及び１から５アミノ酸の短いアミノ酸配列（ポリグリシン配列など）が含まれるが、これらに限定されない。]
[0119] 別の実施形態において、組換え抗体を固相上に固定化するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又はチログロブリンなどの担体タンパク質に組換え抗体を場合によって連結させることが可能である。]
[0120] 別の実施形態において、本開示は、検出可能な標識を取り込ませるための組換え抗体の修飾を提供する。好ましくは、本開示に係る検出可能な標識は、直接又は間接的に検出可能な分子又は部分であり、組換え抗体への検出可能な標識の連結が抗体の標的Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質への特異的結合を好ましくは妨害しないように選択される。抗体を標識する方法は本分野において周知であり、組換え抗体を検出可能な標識に連結するための、例えば、ＳＡＭＳＡ（Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物）などの二官能性架橋物質の使用が含まれる。本分野において公知である又は上記されているものと同様の他の架橋試薬を同様に使用することができる。]
[0121] 本開示の組換え抗体とともに使用するための検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、コロイド状粒子、蛍光性微粒子など、直接検出可能なものが含まれる。検出可能な標識はそれ自体検出可能であり、又は検出可能な産物を生成するために１つ若しくはそれ以上のさらなる化合物と反応させることが可能である。従って、当業者は、本開示の直接検出可能な標識は、標識の検出を可能とするための基質、引き金を引く試薬、光などのさらなる成分を必要とし得ることを理解する。検出可能な標識の例には、発色性物質、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、蛍光性化合物（フルオレセイン、ローダミン、ルテニウムトリスビピリジル及びランタニドキレート誘導体など）、化学発光性化合物（例えば、アクリジニウム及びルミノールなど）、可視的若しくは蛍光性粒子、核酸、錯化剤又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなど）などの触媒が含まれるが、これらに限定されない。酵素を使用する場合、例えば、色素、蛍光又は発光性基質の添加は、好ましくは、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光及びラマン分光測定法などの他の検出系も、場合によって有用である。]
[0122] 本開示は、間接的に検出される標識の使用も提供する。間接的に検出可能な標識は、「親和性対」（すなわち、２つの異なる分子）の使用を通例含み、前記対の第一の要素は本開示の組換え抗体に連結され、前記対の第二の要素は第一の要素に特異的に結合する。前記対の２つの要素間の結合は、典型的には、化学的又は物理的な性質である。このような結合対の例には、抗原及び抗体、アビジン／ストレプトアビジン及びビオチン、ハプテン及びハプテンに対して特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子／基質及び酵素などが含まれるが、これらに限定されない。]
[0123] Ｆ．抗体の調製
ポリクローナル抗体は、免疫原及び所望であれば、アジュバントの１つ以上の注射によって、哺乳動物宿主中に産生され得る。典型的には、免疫原（及びアジュバント）は、複数の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物中に注射される。免疫原は、ＴＣＡ又はＴＣＡ融合ポリペプチドを含むことができる。アジュバントの例には、フロイントの完全及びモノホスホリルリピドＡ合成トレハロースジコリノミコラート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を向上させるために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン及び大豆トリプシン阻害剤など、宿主中において免疫原性であるポリペプチドに免疫原を連結することができる。抗体産生のためのプロトコールは周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， １９８７； Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．， ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ．１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．７２６ ｐｐ； Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．， ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ．１９９９．Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰＲｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。あるいは、ｐＡｂは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリ中で作製することができる（Ｓｃｈａｄｅ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ （ｅｇｇ ｙｏｌｋ） ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＩｇＹ．Ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＥＣＶＡＭ ｗｏｒｋｓｈｏｐ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｔｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ （ＡＴＬＡ）．２４：９２５−９３４）。]
[0124] 所望の抗原に対するモノクローナル抗体を作製する方法は、本分野において周知である。例えば、モノクローナル抗体は、「Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）」によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができる。一般に、ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物（ハムスター又はマカクザル）は、複数部位への抗原並びに担体及び／又はアジュバントの複数回皮下又は腹腔内注射によって免疫化される。二週後、動物に追加免疫を行い、約７から１４日後、動物から採血し、抗抗原力価に関して血清をアッセイする。力価が一定になるまで、動物に追加免疫を施すことができる。]
[0125] マウスの脾細胞を抽出し、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２６６：５５０ （１９７７）参照）。適切な骨髄腫細胞株は本分野において公知であり、ＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫瘍に由来するものなどのマウス骨髄腫株（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能）並びにＳＰ−２、ＳＰ２／０及びＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡから入手可能）が含まれるが、これらに限定されない。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の作製のために記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１−６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）参照）。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中に播種し、増殖させることができる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠如する場合には、ハイブリドーマ用の培地は、通例、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑制する。]
[0126] 次いで、このような選択を通じて得られたハイブリドーマ細胞は、例えば、免疫沈降によって、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって、最初の免疫化において使用されたＴ．ｃｒｕｚｉ抗原を結合することができる抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、「Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）」のＳｃａｔｈｃａｒｄ分析によって、場合によって測定することができる。]
[0127] 所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈操作、例えば、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２ （１９８１））によって記載されている操作によってサブクローニングされ、標準的な方法（例えば、Ｇｏｄｉｎｇｉｂｉｄ、同書参照）によって増殖させることができる。この目的のための適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物中の腹水腫瘍として、インビボで増殖させることができる。]
[0128] サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製操作によって、培地、腹水液又は血清から場合によって単離することができる。]
[0129] 実施例１から４（実施例の部参照）は、ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６及び８のアミノ酸配列によって表されるポリペプチド）中に見出されるＴＣＡに対するｍＡｂを得るための１つのアプローチを例示するに過ぎない。]
[0130] Ｇ．組換え抗体の調製
本開示の組換え抗体は、例えば、ヒト又は非ヒト動物（げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、霊長類又はニワトリなど）によって産生されたモノクローナル抗体由来の抗原結合ドメイン配列（例えば、ＶＨ及び／若しくはＶＬ配列又はその一部）を含むことができる。あるいは、所望の結合活性を有する抗原結合ドメインは、バクテリオファージ、細菌若しくは酵母の表面上でラムダファージ中に発現されたコンビナトリアルライブラリーの使用を通じて選択され、又は標準的な技術を用いて、他の生物学的（例えば、レトロウイルス又はポリソーム）若しくは非生物系上でのディスプレイによってスクリーニングすることができる（例えば、Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ． ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７ （１９９１）； Ｂａｒｂａｓ， Ｃ． Ｆ． Ｉｌｌ ｅｔ． ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４４５７−４４６１ （１９９２）参照）。ライブラリーは、免疫化された又は免疫化されていない宿主から単離された固有の抗原結合ドメイン、合成もしくは半合成の抗原結合ドメイン又は修飾された抗原結合ドメインから構成され得る。]
[0131] １．組換え抗体一般
本開示の一実施形態において、組換え抗体は、目的のＴ．ｃｒｕｚｉに結合するモノクローナル抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。]
[0132] 本開示の一実施形態において、組換え抗体は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に由来するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。別の実施形態において、組換え抗体は、ＦＰ３、ＦＰ６又はＦＰ１０など、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原に産生されたモノクローナル抗体に由来する。別の実施形態において、組換え抗体は、ＦＰ３、ＦＰ６又はＦＰ１０の全て又は断片（例えば、１つ以上のエピトープを含む断片）を含むＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。さらなる実施形態において、組換え抗体は、配列番号２、４又は６の何れか１つに記載されている配列と実質的に同一の配列を含むＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。]
[0133] 場合によって、モノクローナル抗体は、ＨＢＦＰ３、ＨＢＰｅｐ２及びＨＢＦＰ１０からなる群から選択される細胞株によって発現される。別の実施形態において、細胞株はシャーガス８−３６７−１７１である。]
[0134] モノクローナル抗体が調製されたら、モノクローナル抗体又はその可変領域をコードするＤＮＡは、標準的な技術によって、例えば、モノクローナル抗体の重及び軽鎖若しくは可変領域をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、又は保存された領域に対するプライマーを用いるモノクローナル抗体をコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能なＩｇＧプライマーの組）によって、容易に単離することができる。]
[0135] 一旦単離されたら、ＤＮＡは、例えば、適切な発現ベクター中にクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために、イー・コリ細胞、酵母細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）又は本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの適切な宿主細胞中に導入することができる。場合によって、一実施形態において、本開示の抗Ｔ．ｃｒｕｚｉマウス−ヒトキメラ抗体は、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中で産生され、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株は、産業的な使用のために十分な量で産生することができる点で有利である。好ましくは、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株及びＨＥＫ２９３細胞株である。別の好ましい宿主細胞は、Ｂ３．２細胞株（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）又は別のジヒドロ葉酸還元酵素欠失（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）である。]
[0136] あるいは、モノクローナル抗体又はその可変領域をコードするＤＮＡは、本分野において公知の標準的な方法によってキメラ抗体、ヒト化抗体及び抗体断片を作製するために使用することができる。]
[0137] 例えば、キメラモノクローナル抗体は、異なる宿主種に由来する抗体重及び軽鎖定常領域遺伝子を含有する哺乳動物発現ベクター中にモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。安定に組み込まれた又は染色体外要素として存在する多くの真核生物抗体発現ベクターが記載されており、当業者に公知である。一般に、抗体発現ベクターは、重鎖定常領域をコードする遺伝子及び／又は軽鎖定常領域をコードする遺伝子、上流エンハンサー要素並びに適切なプロモーターを含むプラスミドである。]
[0138] 多様な発現調節配列が、本開示において使用され得る。このような有用な発現調節配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随する発現調節配列及び原核若しくは真核細胞若しくはそのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られた任意の配列並びにこれらの様々な組み合わせが含まれる。哺乳動物細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ＳＶ４０及びアデノウイルスの早期及び後期プロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＭＴ−Ｉ（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ドロソフィラ最小熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネータ、ＳＶ４０又はアデノウイルスＥＩｂ領域ポリアデニル化シグナル及びＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， １９６：９４７−５０（１９８７））が含まれる。]
[0139] 例えば、ヒト定常領域に関して、抗体発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１（ヒトＣγ１）及びヒトκ定常領域（ヒトＣκ）遺伝子及び免疫グロブリンＨ鎖エンハンサー要素を含み得る。ベクターは、細菌の複製基点及び選択マーカーも含有し得る。本分野において公知であるように、選択マーカーを場合によって含めることによって、所定の増殖条件下で選択及び増幅を可能とする。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子はメトトレキサートを用いた哺乳動物細胞中での選択及び増幅を提供する。市販の哺乳動物発現ベクターから始まる抗体発現に適したベクターの構築は、当業者によって容易に達成することが可能である。本明細書に記載されているように、ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＯＳベクターを含むベクター及び様々な中間的ベクターなどの様々なベクター並びにプラスミドを、抗体作製のために使用することができる。ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＯＳベクターは、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）から入手した。他の類似のプラスミド及びベクターは、市販されており及び／又は容易に構築される。]
[0140] 適切な宿主細胞中への発現構築物の導入は、所定の特異性の完全なキメラ抗体の産生をもたらす（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５ （１９８４）参照）。重及び軽鎖コード配列は、別個のプラスミド上に個別に宿主種細胞中へ導入し、又は同じベクター上に一緒に導入することができる。]
[0141] 使用されるベクター系に応じて、多くの異なる不死化された細胞株が適切な宿主細胞としての役割を果たすことができ、これらには、骨髄腫（例えば、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ハイブリドーマ（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）、リンパ腫、昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）、ヒト胎児性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）及びチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。発現構築物は、リン酸カルシウム沈殿、プロトプラスト融合、リポフェクション、レトロウイルス由来のシャトルベクター及び電気穿孔などの（但し、これらに限定されない。）本分野において公知の様々な技術を用いて宿主細胞中に導入することができる。]
[0142] キメラ抗体及び抗体断片は、バキュロウイルス、酵母、細菌（イー・コリなど）などの（但し、これらに限定されない。）他の発現系中で及びウサギ赤血球網状赤血球可溶化液などの無細胞系中インビトロで作製することもできる。]
[0143] 組換え抗体は、例えば、クロスフローろ過、硫安沈殿、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー又はこれらの組み合わせなどの標準的な免疫グロブリン精製操作によって宿主細胞から単離され得る。]
[0144] あるいは、抗体断片は、慣用の酵素的方法によって精製された抗体調製物から作製することが可能であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、完全な状態の抗体のペプシン切断によって作製することができ、Ｆａｂ断片は、パパインで完全な状態の抗体を短時間消化することによって作製することができる。]
[0145] 少なくとも２つの異なる抗原に対して特異性を有する組換え二重特異的及びヘテロ連結抗体断片は、完全長抗体として又は抗体断片（Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体断片など）として調製することができる。３以上の価数（例えば、三価以上の価数の抗体断片）を有する抗体断片も想定される。二重特異的抗体、ヘテロ連結抗体及び多価抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって調製することができる。]
[0146] ２．一価抗体
一価抗体は互いに架橋しない。１つの方法は、Ｉｇ軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。一般にＦｃ領域中の何れかの点での重鎖末端切断は、重鎖架橋を妨げる。あるいは、適切なシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換され又は欠失され、ジスルフィド結合による架橋を妨げる。インビトロ法は、一価抗体を調製するのにも適している。抗体は、Ｆａｂなどの断片を作製するために消化することができる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，上記；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９９９，上記）。]
[0147] ３．ヒト化及びヒト抗体
ＴＣＡを結合する非ヒト抗体のヒト化された形態は、非ヒトＩｇに由来する最小配列を含有するキメラＩｇ、Ｉｇ鎖又は断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合配列など）である。]
[0148] 一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「輸入」可変ドメインから通例採取される「輸入」残基としばしば称される。ヒト化は、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって達成される（Ｊｏｎｅｓ， Ｐ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ３２１：５２２−５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｒｅｓｈａｐｉｎｇｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３３２：３２３−７； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３９：１５３４−６）。このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより大幅に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９）である。実際に、典型的には、ヒト化抗体は、幾つかのＣＤＲ残基及びおそらくは幾つかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位から得られる残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（マウス、ラット又はウサギなど）のＣＤＲ（ドナー抗体）から得られる残基によって置換されているヒトＩｇ（レシピエント抗体）が含まれる。幾つかの例では、対応する非ヒト残基は、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基を置換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、輸入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含有し、全てではなくてもＣＤＲ領域の殆どが非ヒトＩｇのものに対応し、全てではなくてもＦＲ領域の殆どがヒトＩｇコンセンサス配列のものに対応している。最適には、ヒト化抗体は、Ｉｇ定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒトＩｇのＩｇ定常領域の少なくとも一部も含む（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， １９８６； Ｐｒｅｓｔａ， １９９２； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， １９８８）。]
[0149] ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ １９９１．Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｆａｂ） ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：４１３３−７； Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｐｈａｇｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）及びヒトモノクローナル抗体（Ｂｏｅｒｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｐｒｉｍｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５； Ｒｅｉｓｆｅｌｄ， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｓ． Ｓｅｌｌ．１９８５．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｃｈｅ−ＵＣＬＡ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｈｅｌｄ ｉｎ ＰａｒｋＣｉｔｙ， Ｕｔａｈ， Ｊａｎｕａｒｙ ２６−Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２， １９８５． Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．６０９ ｐｐ）などの、様々な技術を用いて作製することもできる。内在性Ｉｇ遺伝子が部分的に又は完全に不活化されたトランスジェニック動物中にヒトＩｇ遺伝子を導入することが、ヒト抗体を合成するために活用することができる。攻撃誘発を行うと、ヒト抗体の産生が観察され、ヒト抗体の産生は、遺伝子再配置、集合及び抗体レパートリーなどのあらゆる点で、ヒトにおいて見られるものと極めて似通っている（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ ｈｕｍａｎＩｇＧｋａｐｐａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−５１； Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ， １９９５； Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， １９９４； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｋａｙ．米国特許第５５６９８２５号。１９９６； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ． Ｋａｙ．米国特許第５６３３４２５号。１９９７ａ； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ． Ｋａｙ．米国特許第５６６１０１６号。１９９７ｂ； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ． Ｋａｙ．米国特許第５６２５１２６号。１９９７ｃ； Ｓｕｒａｎｉ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．米国特許第５５４５８０７号。１９９６）。]
[0150] ３．二重特異的抗体
二重特異的モノクローナル抗体は、少なくとも２つの異なる抗原を結合する。例えば、結合特異性はＴＣＡであり、その他は選択した任意の抗原に対する。]
[0151] 二重特異的抗体の組換え産生は、しばしば、２つのＩｇ重鎖／軽鎖対（各々が異なる特異性を有する。）を同時発現させることによって達成される。得られたハイブリドーマ（クアドローマ）中でのこれらのＩｇ重及び軽鎖の無作為な集まりは、１０の異なる分子の潜在的混合物を与え、そのうち１つのみが所望の二重特異的構造を有する。所望の抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は他の技術を用いて精製することができる（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｍｙｅｌｏｍａ ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１０９−１３； Ｗａｂｌ， Ｍ．， Ｊ． Ｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｅ． Ｌｏｔｓｃｈｅｒ．ＷＯ９３／０８８２９。１９９３）。]
[0152] 二重特異的抗体を製造するために、所望の抗体−抗原結合部位を有する可変ドメインはＩｇ定常ドメイン配列に融合される（Ｓｕｒｅｓｈ， Ｍ．Ｒ．， Ａ． Ｃ． Ｃｕｅｌｌｏ， ａｎｄ Ｃ． Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．１９８６．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２８）。融合は、通常、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインと行われる。軽鎖結合のために必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合の少なくとも１つの中に存在する。Ｉｇ重鎖融合及び所望であれば、Ｉｇ軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターの中に挿入され、適切な宿主生物中に同時形質移入される。]
[0153] 抗体分子の対間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大化するために改変することができる（Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ．， Ｌ． ｅｔ ａｌ．ＷＯ ９６／２７０１１．１９９６）。この方法において、第一の抗体分子の界面に由来する１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換することによって、大きな側鎖と同一又は類似のサイズの補償的「空洞」が第二の抗体分子の界面上に作製される。この機構は、ホモ二量体などの望ましくない最終産物に対するヘテロ二量体の収率を増加させる。]
[0154] 二重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆａｂ’２二重特異的抗体）として調製することができる。二重特異的抗体を作製するための１つの技術は、化学的連結を活用する。完全な抗体は、Ｆａｂ’２断片を作製するためにタンパク分解的に切断され得る（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９８５．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ１ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２９：８１−３）。断片は、隣接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を抑制するために、亜ヒ酸ナトリウムなどのジチオール錯化剤を用いて還元される。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体へ転化される。次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によって、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つはＦａｂ’−チオールへ再度転化され、二重特異的抗体を形成するために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル濃度量と混合される。]
[0155] Ｆａｂ’断片は、イー・コリから直接回収し、二重特異的抗体を形成するために化学的結合され得る。例えば、完全にヒト化された二重特異的Ｆａｂ’２抗体を作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙ， Ｍ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅＨＥＲ２ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７５：２１７−２５）。各Ｆａｂ’断片はイー・コリから別個に分泌され、インビトロで化学的に直接結合され、二重特異的抗体を形成する。]
[0156] 組換え細胞培養から直接得られる二重特異的抗体断片を作製及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを使用することができる（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ， Ｓ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３）。Ｆｏｓ及びＪｕｎポリペプチドから得られるペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結されている。抗体ホモ二量体は、単量体を形成するために、ヒンジ領域において還元され、次いで、抗体へテロ二量体を形成するために再酸化される。この方法は、抗体ホモ二量体を作製することもできる。「ダイアボディ」技術は、二重特異的抗体断片を作製するための別の方法を提供する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３）。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能とするほど十分に短いリンカーによって、軽鎖ＶＬに接続された重鎖ＶＨからなる。１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対合され、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異的抗体断片を作製するための別の戦略は、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用である（Ｇｒｕｂｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８−７４）。三重特異的抗体などの３以上の価数を有する抗体も作製することができる（Ｔｕｔｔ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）３ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈａｔ ｕｓｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｖｉａ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ＣＤ２ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｉｒｅｃｔ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−９）。典型的な二重特異的抗体は、所定のＴＣＡ上の２つの異なるエピトープに結合することができる。]
[0157] Ｈ．組換え抗体の検査
組換え抗体が標的Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原に特異的に結合する能力は、標準的な免疫学的技術によって評価することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）。例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）による。本開示の一実施形態において、組換え抗体は、抗原結合ドメインが由来するモノクローナル抗体と実質的に同じ特異性を示す。]

权利要求:

請求項1
Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する１つ以上の抗体を含む免疫診断試薬であって、前記１つ以上の抗体は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドに対して特異的な抗体からなる群から選択される、免疫診断試薬。
請求項2
免疫診断試薬が前記抗体の２つ以上を含む、請求項１に記載の免疫診断試薬。
請求項3
免疫診断試薬が（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＲＡであり、並びにさらに、抗体が約７．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約７．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約４．０×１０−３ｓ−１から約３．０×１０−１ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約５．７×１０−１０Ｍから約４．３×１０−７Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＰｅｐ２であり、並びにさらに、抗体が約１．０×１０６Ｍ−１ｓ−１から約８．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約６．０×１０−３ｓ−１から約４．０×１０−２ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約７．５×１０−１０Ｍから約４．０×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ１０であり、並びにさらに、抗体が（ａ）約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１から約３．０×１０５Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、（ｂ）約１．０×１０−４ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び（ｃ）約３．３×１０−１０Ｍから約１．６×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ３であり、並びにさらに、抗体が約２．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約６．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約２．０×１０−５ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約３．３×１０−１２Ｍから約４．０×１０−９Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；並びに（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせからなる群から選択される抗体を含む、請求項１から２の何れかに記載の免疫診断試薬。
請求項4
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１から３の何れかに記載の免疫診断試薬。
請求項5
免疫診断試薬が（ａ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｂ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｃ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｄ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｅ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｆ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｇ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｈ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｉ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｊ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｋ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｌ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｍ）配列番号２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｎ）配列番号４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｏ）配列番号６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び（ｐ）配列番号８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項１から４の何れかに記載の免疫診断試薬。
請求項6
前記キメラ抗体が（１）（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；からなる群から選択されるＶＨ領域：（２）（ａ）配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｂ）配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｃ）配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；及び（ｄ）配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；からなる群から選択されるＶＬ領域：又は（３）（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；並びに（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域：を含む、請求項５に記載の免疫診断試薬。
請求項7
前記キメラ抗体が、（ａ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体；又は（ｂ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体；と実質的に同一である、請求項６に記載の免疫診断試薬。
請求項8
免疫診断試薬が検出試薬、標準化試薬及び陽性対照試薬からなる群から選択される試薬である、請求項１から８の何れかに記載の免疫診断試薬。
請求項9
ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体。
請求項10
抗体が（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＲＡであり、並びにさらに、抗体が約７．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約７．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約４．０×１０−３ｓ−１から約３．０×１０−１ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約５．７×１０−１０Ｍから約４．３×１０−７Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体が約１．０×１０６Ｍ−１ｓ−１から約８．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約６．０×１０−３ｓ−１から約４．０×１０−２ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約７．５×１０−１０Ｍから約４．０×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ１０であり、並びにさらに、抗体が（ａ）約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１から約３．０×１０５Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、（ｂ）約１．０×１０−４ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び（ｃ）約３．３×１０−１０Ｍから約１．６×１０−８Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ３であり、並びにさらに、抗体が約２．０×１０５Ｍ−１ｓ−１から約６．０×１０６Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度定数（ｋａ）、約２．０×１０−５ｓ−１から約８．０×１０−４ｓ−１の間の解離速度定数（ｋｄ）及び約３．３×１０−１２Ｍから約４．０×１０−９Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；並びに（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
請求項11
抗体がキメラ抗体である、請求項９又は１０の抗体。
請求項12
（ａ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｂ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｃ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｄ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｅ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｆ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｇ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｈ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｉ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｊ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｋ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び（ｌ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；からなる群から選択される、請求項１１に記載のキメラ抗体。
請求項13
キメラ抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片からなる群から選択される１つである、請求項９から１２のキメラ抗体。
請求項14
抗体がモノクローナルである、請求項９から１３のキメラ抗体。
請求項15
キメラ抗体が（ａ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体；又は（ｂ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から選択される細胞株によって発現される抗体；と実質的に同一である、請求項９から１４のキメラ抗体。
請求項16
Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体を発現する細胞株であって、前記細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株からなる群から選択される、細胞株。
請求項17
請求項１に記載の免疫診断試薬を感度パネルとして使用することを含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイを標準化する方法。
請求項18
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を検出するための方法であって、（ａ）キメラ抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を含有すると疑われる検査試料を請求項４に記載の免疫診断試薬と接触させる工程；及び（ｂ）前記Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の存在の指標として形成された何れかのキメラ抗体：抗原複合体を検出する工程を含む、方法。
請求項19
キメラ抗体が検出可能な標識を含む、請求項１８の方法。
請求項20
抗体：抗原複合体が二次抗体又はその断片と接触され、前記二次抗体又はその断片が検出可能な標識を含む、請求項１８の方法。
請求項21
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を検出するための方法であって、（ａ）抗原：抗体複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を含有すると疑われる検査試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体に対して特異的な１つ以上のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原と接触させる工程、及び（ｂ）前記Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の存在を示唆するものとして形成された何れかの抗原：抗体複合体を検出する工程を含み請求項４に記載の免疫診断試薬は、陽性対照又は標準化試薬として、前記方法において使用される、方法。
請求項22
請求項１の免疫診断試薬を含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉを検出するための診断キット。
請求項23
ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部を含む単離されたポリペプチド。
請求項24
前記キメラ抗体が（ａ）配列番号２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｂ）配列番号４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｃ）配列番号６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び（ｄ）配列番号８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体からなる群から選択される、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
請求項25
ポリペプチドが（１）（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；からなる群から選択されるＶＨ領域：（２）（ａ）配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｂ）配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｃ）配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；及び（ｄ）配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；からなる群から選択されるＶＬ領域：又は（３）（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；並びに（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域：を含む、請求項２４に記載の単離されたポリペプチド。
請求項26
ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部をコードする単離されたポリヌクレオチド。
請求項27
前記キメラ抗体が（ａ）配列番号２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｂ）配列番号４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；（ｃ）配列番号６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び（ｄ）配列番号８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体からなる群から選択される、請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項28
ポリペプチドが（１）（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域；からなる群から選択されるＶＨ領域：（２）（ａ）配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｂ）配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｃ）配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；及び（ｄ）配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；からなる群から選択されるＶＬ領域：（３）（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；並びに（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域：を含む、請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項29
配列番号１、３、５又は７に記載されているアミノ酸によって含まれるＴ．ｃｒｕｚｉアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するＴ．ｃｒｕｚｉアミノ酸配列を含む抗原を精製する方法であって、（ａ）キメラ抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドを含有すると疑われる試料を請求項１に記載の免疫診断試薬と接触させること；（ｂ）形成されたキメラ抗体：抗原複合体を単離すること；及び（ｃ）抗体から抗原を分離すること；を含む、方法。