セルロース分解増強活性を有するポリペプチドとこれをコードするポリヌクレオチド

专利摘要:
本発明は、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドと、該ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドとに関する。本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含む核酸構築体、ベクター、及び宿主細胞、ならびに該ポリペプチドを製造及び使用するための方法に関する。
公开号:JP2011507525A
申请号:JP2010539794
申请日:2008-12-18
公开日:2011-03-10
发明作者:ハリス，ポール；ブラウン，キンバリー；メイユラン，スチンドラ
申请人:ノボザイムス アクティーゼルスカブ；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 配列リストの参照
本出願は、コンピューターで読める形で配列リストを含む。このコンピューターで読める形は、参照することにより本明細書に組み込まれる。]
[0002] 生物学的材料の寄託の参照
本出願は、生物学的材料の寄託への参照を含み、この寄託は参照することにより本明細書に組み込まれる。]
[0003] 発明の分野
本発明は、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドと、このポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチドを含む核酸構築体、ベクター、及び宿主細胞、ならびにこのポリペプチドの製造法と使用法とに関する。]
背景技術

[0004] 関連技術の説明
セルロースは、ベータ−１，４−結合により連結された単糖グルコースのポリマーである。多くの微生物は、ベータ結合グルカンを加水分解する酵素を産生する。これらの酵素には、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びベータグルコシダーゼがある。エンドグルカナーゼはセルロースポリマーをランダムな位置で消化して、これを開環してセロビオヒドロラーゼの攻撃を受けやすくする。セロビオヒドロラーゼは、セルロースポリマーの末端からセロビオースの分子を連続的に放出する。セロビオースは、グルコースの水溶性ベータ−１，４−結合ダイマーである。ベータグルコシダーゼはセロビオースを加水分解してグルコースにする。]
[0005] リグノセルロース原料のエタノールへの変換は、大量の原料が容易に入手でき、原料の消却や埋め立てが避けられ、及びエタノール燃料が清潔であるという利点がある。木材、農業残渣、草本作物、及び自治体の固体廃棄物は、エタノール生産の原料であると考えられている。これらの材料は、主にセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンからなる。セルロースはいったんグルコースに変換されると、グルコースは酵母により容易に発酵されてエタノールになる。]
[0006] セルロース系原料を変換する能力を改良することは、当該分野において有益であろう。]
[0007] ＷＯ２００６／０７４６４７号は、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドと、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）からのそのポリヌクレオチドを開示する。ＷＯ２００５／０７４６５６号は、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドと、サーモアスカス・オーランチアカス（Thermoascus aurantiacus）からのそのポリヌクレオチドを開示する。ＷＯ２００７／０８９２９０号は、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドと、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）からのそのポリヌクレオチドを開示する。]
[0008] 本発明は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドと、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。]
課題を解決するための手段

[0009] 発明の要約
本発明は、以下よりなる群から選択されるセルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）少なくとも中程度の厳密性条件下で、（ｉ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に含まれるｃＤＮＡ配列と、又は（iii）（ｉ）もしくは（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドの１つ又はそれ以上（数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変種。]
[0010] 本発明はまた、以下よりなる群から選択されるセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する：
（ａ）配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも中程度の厳密性条件下で、（ｉ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に含まれるｃＤＮＡ配列と、又は（iii）（ｉ）もしくは（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドの１つ又はそれ以上（数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変種をコードするポリヌクレオチド。]
[0011] 本発明はまた、核酸構築体、組換え発現ベクター、そのポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞、及びセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの製造法に関する。]
[0012] 本発明はまた、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を細胞に投与するか又は細胞中に発現することを含む、細胞中のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの発現を阻害する方法であって、ｄｓＲＮＡは本発明のポリヌクレオチドのサブ配列を含むことを特徴とする方法に関する。本発明はまた、かかる２本鎖阻害性ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子に関し、ここでｄｓＲＮＡは随時ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ分子である。]
[0013] 本発明はまた、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在下で、セルロース系材料をセルロース分解酵素組成物で処理することを含んでなる、セルロース系材料を分解又は変換するための方法で、ここでセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが存在しない場合と比較して、セルロース系材料の分解を上昇させることを特徴とする方法に関する。]
[0014] 本発明はまた、発酵生成物を製造する方法であって、（ａ）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在下で、セルロース系材料をセルロース分解酵素組成物で糖化し（ここで、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが存在しない場合と比較して、セルロース系材料の分解を上昇させる）；（ｂ）工程（ａ）の糖化したセルロース系材料を１つ又はそれ以上の発酵微生物で発酵させて発酵生成物を生成させ、そして（ｃ）発酵物から発酵生成物を回収することを含んでなる方法に関する。]
[0015] 本発明はまた、セルロース系材料を１つ又はそれ以上の発酵微生物で発酵させることを含んでなるセルロース系材料の発酵方法であって、ここで、セルロース系材料は、本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在下で、セルロース分解酵素組成物で加水分解され、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが存在しない場合と比較して、セルロース系材料の加水分解を上昇させることを特徴とする方法に関する。]
[0016] 本発明はまた、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む植物に関する。]
[0017] 本発明はまた、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物又は植物細胞を、ポリペプチドの産生を促進する条件下で培養し、（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法に関する。]
[0018] 本発明はさらに、タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構築体であって、遺伝子は、配列番号２のアミノ酸１〜１７又は配列番号４のアミノ酸１〜１５を含むかもしくはこれからなるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能できる形で結合しており、遺伝子はヌクレオチド配列に対して異物であることを特徴とする核酸構築体に関する。]
図面の簡単な説明

[0019] セルロース分解増強活性を有するミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ＣＢＳ２０２．７５ＧＨ６１ＡポリペプチドのゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列とを示す（それぞれ、配列番号１と２）。
ｐＳＭａｉ１９０の制限地図を示す。
セルロース分解増強活性を有するミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ＣＢＳ２０２．７５ ＧＨ６１ＦポリペプチドのゲノムＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列とを示す（それぞれ、配列番号３と４）。
ｐＳＭａｉ１９２の制限地図を示す。
ｐＳＭａｉ１８５の制限地図を示す。
ｐＳＭａｉ１９８の制限地図を示す。
前処理したトウモロコシ茎葉の酵素的加水分解に対する、セルロース分解増強活性を有するミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ＧＨ６１ＡとＧＨ６１Ｆポリペプチドの作用を示す。]
[0020] 定義
セルロース分解増強活性：本明細書において用語「セルロース分解増強活性」は、セルロース分解活性を有するタンパク質によるセルロース系材料の加水分解を増強する生物活性として規定される。本発明の目的においてセルロース分解増強活性は、セルラーゼタンパク質によるセルロース系材料の加水分解からの、還元糖の増加又はセロビオースとグルコースの合計の増加を、以下の条件により測定することにより決定される：１〜５０mgの総タンパク質／ＰＣＳ中のセルロースｇ数（ここで、総タンパク質は、ＰＣＳ中のセルロース１ｇ当たり８０〜９９．５％w/wの総タンパク質と、０．５〜２０％w/wのセルロース分解増強活性を有するタンパク質からなる）を５０℃で１〜７日間を、セルロース分解増強活性の無い同様の総タンパク質添加（１〜５０mgの総タンパク質／ＰＣＳ中のセルロースｇ数）による対照加水分解と比較。好適な態様において３％の総タンパク質重量の麹菌（Aspergillus oryzae）ベータグルコシダーゼ（ＷＯ０２／０９５０１４号の実施例２２の麹菌（Aspergillus oryzae）で組換え産生）、又は３％の総タンパク質重量のアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）ベータグルコシダーゼ（ＷＯ０２／０９５０１４号の実施例２２の麹菌（Aspergillus oryzae）で組換え産生）のセルラーゼタンパク質添加の存在下で、CELLUCLAST（登録商標）混合物１．５リットル（Novazymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）を、セルロース分解活性の供給源として使用する。]
[0021] セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドのセルロース分解増強活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも１００％を有する。]
[0022] セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、同程度の加水分解に達するのに必要なセルロース分解酵素の量を、好ましくは少なくとも０．１倍、さらに少なくとも０．２倍、さらに好ましくは少なくとも０．３倍、さらに好ましくは少なくとも０．４倍、さらに好ましくは少なくとも０．５倍、さらに好ましくは少なくとも１倍、さらに好ましくは少なくとも３倍、さらに好ましくは少なくとも４倍、さらに好ましくは少なくとも５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも２０倍、さらに好ましくは少なくとも３０倍、さらに好ましくは少なくとも５０倍、そして最も好ましくは少なくとも１００倍低下させることにより、セルロース分解増強活性を有するタンパク質により触媒されるセルロース系材料の加水分解を増強する。]
[0023] セルロース分解活性：本明細書において用語「セルロース分解活性」は、セルロース系材料を加水分解する生物活性として規定される。セルロース分解性タンパク質は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を加水分解し、こうしてインキュベーション混合物の粘度を低下させる。得られる粘度の低下は、振動粘度計（例えば、Sofrasser，FranceのMIVI3000）により測定される。セルラーゼ粘度単位（ＣＥＶＵ）として測定されるセルラーゼ活性の測定は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液の粘度を低下させる試料の能力を測定することにより、試料中に存在する触媒活性の量を定量する。このアッセイは、セルロース分解性タンパク質と基質に適した温度とｐＨで行われる。CELLUCLAST（登録商標）（Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）について、アッセイは、ＣＭＣを基質（３３．３g/L カルボキシメチルセルロース Hercules 7LFD）として、約３．３〜４．２CEVU/mlの酵素濃度で、４０℃で０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ９．０）中で３０分間行われる。ＣＥＶＵ活性は、宣言された酵素スタンダード、例えばCELLUZYME（登録商標）Standard 7-1194（Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkから得られる）に対して計算される。]
[0024] 本発明の目的においてセルロース分解活性は、以下の条件下でセルロース分解性混合物によるセルロース系材料の加水分解の上昇を測定することにより決定される：セルロース分解性タンパク質の添加の無い対照加水分解と比較して、１〜１０mgのセルロース分解性タンパク質／１ｇのＰＣＳ中のセルラーゼで５０℃で５〜７日間。]
[0025] エンドグルカナーゼ：本明細書において用語「エンドグルカナーゼ」は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシルエチルセルロース）、リケニン中の１，４−ベータ−Ｄ−グリコシド結合、穀類ベータ−Ｄ−グルカン類又はキシログルカン類のような混合ベータ−１，３−グルカン類、及びセルロース性成分を含有する他の植物材料中のベータ−１，４−結合の、内部加水分解（endohydrolysis）を触媒するエンド−１，４−（１，３；１，４）−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．３．２．１．４）として規定される。本発明の目的において、エンドグルカナーゼ活性は、Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59:257-268の方法に従ってカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を使用して測定される。]
[0026] セロビオヒドロラーゼ：本明細書において用語「セロビオヒドロラーゼ」は、セルロース、セロオリゴ糖、又は任意のベータ−１，４−結合グルコース含有ポリマー中の１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒して、鎖の還元末端又は非還元末端からセロビオースを放出する、１，４−ベータ−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．３．２．１．９１）として規定される。本発明の目的において、セロビオヒドロラーゼ活性は、Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47:273-279、及び van Tibeurgh et al., 1982, FEBSLetters 149:152-156; van Tibeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187:283-288に記載された方法に従って測定される。本発明において、トウモロコシ茎葉中のセルロースの加水分解を評価するためにLever et al.の方法が使用され、蛍光性二糖誘導体上のセロビオヒドロラーゼ活性を測定するためにTilbeurgh et al.の方法が使用された。]
[0027] ベータグルコシダーゼ：本明細書において用語「ベータグルコシダーゼ」は、末端の非還元ベータ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒してベータ−Ｄ−グルコースの放出を伴うベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）として規定される。本発明の目的において、ベータグルコシダーゼ活性は、Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42:55-66に記載の基本的な方法により測定されるが、そこに記載されたものとは異なる条件が使用された。１単位のベータグルコシダーゼ活性は、１００mMクエン酸ナトリウム、０．０１％ツイーン（登録商標）２０中の４mM ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドから、ｐＨ５で５０℃で１分間に１．０μモルのｐ−ニトロフェノールが産生されると規定される。]
[0028] ファミリー６１グリコシドヒドラーゼ：本明細書において用語「ファミリー６１グリコシドヒドラーゼ」又は「ファミリーＧＨ６１」は、Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280:309-316、及びHenrisaat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316:695-696に従って、グリコシドヒドロラーゼファミリー６１に分類されるポリペプチドと規定される。現在Henrissatは、ＧＨ６１ファミリーを分類せずに列記し、このファミリーに属するポリペプチドについて、機構、触媒性求核物質／塩基、触媒性プロトンドナー、及び３Ｄ構造が不明であるとしている。]
[0029] セルロース系材料：セルロース系材料は、セルロースを含む任意の材料である。バイオマスの一次細胞壁の主要な多糖はセルロースであり、第２に豊富な物質はヘミセルロースであり、第３はペクチンである。細胞が増殖を停止した後に生成される２次細胞壁はまた多糖を含有し、ヘミセルロースに共有的に架橋したポリマーリグニンにより強化される。セルロースはアンヒドロセロビオースのホモポリマーであり、従って線状ベータ−（１，４）−Ｄ−グルカンであり、ヘミセルロースは種々の化合物（例えば、キシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、及びマンナン）を一連の置換基との複合分岐構造で含む。セルロースは一般には多型体であるが、植物組織中に主に並行グルカン鎖の不溶性結晶性マトリックスとして存在する。ヘミセルロースは、通常セルロースならびに他のヘミセルロースに水素結合しており、これが細胞壁マトリックスの安定化を助ける。]
[0030] セルロースは、一般に例えば植物の茎、葉、外皮、殻、及び穂軸、又は木の葉、枝、及び木質に存在する。セルロース系材料は、特に限定されないが、草本物質、農業残渣、森林残渣、自治体の固形廃棄物、紙くず、パルプ、及び製紙工場残渣である。セルロース系材料は任意のタイプのバイオマスであり、特に限定されないが、森林資源、自治体の固形廃棄物、紙くず、作物、作物残渣がある（例えば、Wiselogel et al., 1995, Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, 編者）、pp. 105-118中、Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50:3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25:695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology中, T. Scheper,編集長, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag、New York）。本明細書においてセルロースは、リグノセルロース、リグニンを含む植物細胞壁物質、セルロース、及び混合マトリックス中のヘミセルロースの形でもよい。好適な態様においてセルロース系材料はリグノセルロースである。]
[0031] ある態様においてセルロース系材料は草本物質である。別の態様においてセルロース系材料は農業残渣である。別の態様においてセルロース系材料は、森林残渣である。別の態様においてセルロース系材料は、自治体の固定廃棄物である。別の態様においてセルロース系材料は、紙くずである。別の態様においてセルロース系材料は、パルプ及び製紙工場残渣である。]
[0032] 別の態様においてセルロース系材料はトウモロコシ茎葉である。別の態様においてセルロース系材料はトウモロコシ繊維である。別の態様においてセルロース系材料はオレンジの皮である。別の態様においてセルロース系材料は稲わらである。別の態様においてセルロース系材料は麦わらである。別の態様においてセルロース系材料はスイッチグラス（switch grass）である。別の態様においてセルロース系材料はススキ（miscanthus）である。別の態様においてセルロース系材料はバガスである。]
[0033] 別の態様においてセルロース系材料は微結晶セルロースである。別の態様においてセルロース系材料は細菌性セルロースである。]
[0034] セルロース系材料はそのまま使用されるか、又は本明細書に記載のように当該分野で公知の従来法を使用して前処理される。好適な態様においてセルロース系材料は前処理される。]
[0035] 前処理トウモロコシ茎葉：本明細書において用語「ＰＣＳ」又は「前処理トウモロコシ茎葉」は、トウモロコシ茎葉の熱と希酸による処理から得られるセルロース系材料として規定される。]
[0036] 単離されたポリペプチド：本明細書において用語「単離されたポリペプチド」は、供給源から単離されたポリペプチドを意味する。好適な態様においてポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定すると、少なくとも１％の純度、好ましくは少なくとも５％の純度、さらに好ましくは少なくとも１０％の純度、さらに好ましくは少なくとも２０％の純度、さらに好ましくは少なくとも４０％の純度、さらに好ましくは少なくとも６０％の純度、さらに好ましくは少なくとも８０％の純度、そして最も好ましくは少なくとも９０％の純度である。]
[0037] 実質的に純粋なポリペプチド：本明細書において用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、さらに好ましくは最大６重量％、さらに好ましくは最大５重量％、さらに好ましくは最大４重量％、さらに好ましくは最大３重量％、さらに好ましくは最大２重量％、さらに好ましくは最大１重量％、そして最も好ましくは最大０．５重量％の他のポリマー物質（ここに、ポリペプチドが本来又は組換え法で結合している）を含む。従って実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する総ポリペプチド物質の少なくとも９２重量％の純度、好ましくは少なくとも９４重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９５重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９６重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９７重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９８重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９９重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９９．５重量％の純度、そして最も好ましくは少なくとも１００重量％の純度である。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な型であり、すなわちポリペプチド調製物が、これが本来又は組換え法で結合している他のポリペプチド物質を基本的に含まない。これは、例えば公知の組換え法又は古典的精製法によりポリペプチドを調製することにより行うことができる。]
[0038] 成熟ポリペプチド：本明細書において用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳と翻訳後修飾（例えば、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端末端切断、グリコシル化、リン酸化など）の後の最終型のポリペプチドとして規定される。好適な態様において成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１７がシグナルペプチドであると予測するSignalPプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1-6）に基づいて、配列番号２のアミノ酸１８〜２３２である。別の好適な態様において成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜１５がシグナルペプチドであると予測するSignalPプログラムに基づいて、配列番号４のアミノ酸１６〜２３５である。]
[0039] 成熟ポリペプチドコード配列：本明細書において用語「成熟ポリペプチドコード配」は、セルロース分解増強活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として規定される。好適な態様において成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜５１がシグナルペプチドであると予測するSignalPプログラムに基づいて、配列番号１のヌクレオチド５２〜９２１である。別の好適な態様において成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号３のヌクレオチド１〜４５がシグナルペプチドであると予測するSignalPプログラムに基づいて、配列番号３のヌクレオチド４６〜８５１である。]
[0040] 同一性：２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の関連は、「同一性」というパラメータにより説明される。]
[0041] 本発明の目的において２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trendsin Genetics 16:276-277）のNeedleプログラム（好ましくは、バージョン3.0.0又はそれ以後）で実施されるように、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用して測定される。使用される随時のパラメータは、ギャップオープンペナルティ（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティ（gap extension penalty）が０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSS版）置換マトリックスである。Needle名前付き「最長同一性（longest identity）」（-nobriedオプションを使用して得られる）の出力は同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される：
（同一の残基×１００）（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）]
[0042] 本発明の目的において、２つのデオキシヌクレオチド配列間の同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 前述）のNeedleプログラム（好ましくは、バージョン3.0.0又はそれ以後）で実施されるように、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 前述）を使用して測定される。使用される随時のパラメータは、ギャップオープンペナルティ（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティ（gap extension penalty）が０．５、及びEDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSS版）置換マトリックスである。Needle名前付き「最長同一性（longest identity）」（-nobriedオプションを使用して得られる）の出力は同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される：
（同一のデオキシヌクレオチド×１００）（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）]
[0043] 相同配列：本明細書において用語「相同配列」は、配列番号２もしくは配列番号４のセルロース分解増強活性を有するマイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophilia）ポリペプチド又はその成熟ポリペプチドを用いて、tfasty検索（Pearson, W.R., 1999, Bioinformatics Methodsand Protocols中, S. Misener and S.A. Krawetz編、pp. 185-219）で、０．００１未満のＥ値（予測スコア（expectancy score））を有する予測されるタンパク質として規定される。]
[0044] ポリペプチドフラグメント：本明細書において用語「ポリペプチドフラグメント」は、配列番号２もしくは配列番号４の成熟ポリペプチドの、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端から１つ又はそれ以上の（数個の）アミノ酸が欠失されたポリペプチド又はその相同配列として規定され、ここでフラグメントはセルロース分解増強活性を有する。好適な態様においてフラグメントは、配列番号２の成熟ポリペプチド又はその相同配列の、少なくとも１８５アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも１９５アミノ酸残基、及び最も好ましくは少なくとも２０５アミノ酸残基を含有する。別の好適な態様においてフラグメントは、配列番号４の成熟ポリペプチド又はその相同配列の、少なくとも１９０アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２００アミノ酸残基、及び最も好ましくは少なくとも２１０アミノ酸残基を含有する。]
[0045] サブ配列：本明細書において用語「サブ配列」は、配列番号１もしくは配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列の５’末端及び／又は３’末端から、１つ又はそれ以上の（数個の）ヌクレオチドが欠失されたヌクレオチド配列、又はその相同配列として規定され、ここでサブ配列はセルロース分解増強活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。好適な態様においてサブ配列は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列又はその相同配列の、少なくとも５５５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５８５ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも６１５ヌクレオチドを含有する。別の好適な態様においてサブ配列は、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列又はその相同配列の、少なくとも５７０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも６３０ヌクレオチドを含有する。]
[0046] アレレ変種：本明細書において用語「アレレ変種」は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ又はそれ以上の代替型の任意のものを示す。アレレ変種は、天然には変異により発生し、集団内の多型を引き起こし得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされるポリペプチドに変化無し）でも、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドのアレレ変種は、遺伝子のアレレ変種によりコードされるポリペプチドである。]
[0047] 単離されたポリヌクレオチド：本明細書において用語「単離されたポリヌクレオチド」は、供給源から単離されたポリヌクレオチドを意味する。好適な態様においてポリヌクレオチドは、アガロースゲル電気泳動により測定して、少なくとも１％の純度、好ましくは少なくとも５％の純度、さらに好ましくは少なくとも１０％の純度、さらに好ましくは少なくとも２０％の純度、さらに好ましくは少なくとも４０％の純度、さらに好ましくは少なくとも６０％の純度、さらに好ましくは少なくとも８０％の純度、そして最も好ましくは少なくとも９０％の純度である。]
[0048] 実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書において用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外因性もしくは不要なヌクレオチドを含まないポリヌクレオチド調製物、及び遺伝子工学作成されたタンパク質生産系内での使用に適した形のポリヌクレオチド調製物を意味する。すなわち、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、さらに好ましくは最大６重量％、さらに好ましくは最大５重量％、さらに好ましくは最大４重量％、さらに好ましくは最大３重量％、さらに好ましくは最大２重量％、さらに好ましくは最大１重量％、そして最も好ましくは最大０．５重量％の他のポリヌクレオチド物質（ここに、ポリヌクレオチドが天然に又は組換え法で結合している）を含む。従って実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然に存在する５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域（例えばプロモーター及びターミネーター）を含んでよい。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、少なくとも９０重量％の純度、好ましくは少なくとも９２重量％の純度、好ましくは少なくとも９４重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９５重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９６重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９７重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９８重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９９重量％の純度、そして最も好ましくは少なくとも９９．５重量％の純度である。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは実質的に純粋な型であり、すなわちポリヌクレオチド調製物が、これが天然に又は組換え法で結合している他のポリヌクレオチド物質を基本的に含まない。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はこれらの任意の組合せでもよい。]
[0049] コード配列：本明細書において用語「コード配列」は、ヌクレオチド配列を意味し、これはそのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定する。コード配列の境界は、一般に読みとり枠により決定され、これは通常ＡＴＧ開始コドン又は代替開始コドン（例えばＧＴＧ及びＴＴＧ）で始まり、停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ）で終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、又は組換えヌクレオチド配列でもよい。]
[0050] ｃＤＮＡ：本明細書において用語「ｃＤＮＡ」は、真核細胞から得られる成熟したスプライスされたｍＲＮＡ分子から、逆転写により調製できるＤＮＡ分子として規定される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡに存在するイントロン配列が欠如している。初期１次ＲＮＡ転写体は、成熟したスプライスされたｍＲＮＡとして現れる前の一連の工程により処理されるｍＲＮＡの前駆体である。これらの工程には、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去がある。すなわちｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡは、イントロン配列が欠如している。]
[0051] 核酸構築体：本明細書において用語「核酸構築体」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は本来天然には存在しない形のもしくは合成型の核酸のセグメントを含有するように修飾された、１本鎖又は２本鎖の核酸分子を意味する。核酸構築体という用語は、核酸構築体が本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する時、用語「発現カセット」と同義である。]
[0052] 制御配列：本明細書において用語「制御配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての成分を含むと規定される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に固有であるかもしくは異種でもよく、又は互いに固有であるかもしくは異種でもよい。かかる制御配列には、特に限定されないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターがある。少なくとも制御配列は、プロモーター、及び転写と翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域との結合を促進する特異的制限部位を導入するためのリンカーを具備してもよい。]
[0053] 機能できる形で結合：本明細書において用語「機能できる形で結合」は、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に置かれる配向を意味する。]
[0054] 発現：用語「発現」は、特に限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含む。]
[0055] 発現ベクター：本明細書において用語「発現ベクター」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その発現を与える追加のヌクレオチドに機能できる形で結合した線状もしくは環状ＤＮＡ分子として定義される。]
[0056] 宿主細胞：本明細書において用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築体もしくは発現ベクターを用いて、形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受ける任意のタイプの細胞を含む。]
[0057] 修飾：本明細書において用語「修飾」は、配列番号２もしくは配列番号４の成熟ポリペプチドからなるポリペプチド又はその相同配列の化学修飾、ならびにかかるポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子操作を意味する。修飾は、１つ又はそれ以上（数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入、ならびに１つ又はそれ以上（数個）のアミノ酸側鎖の置換でもよい。]
[0058] 人工的変種：本明細書において用語「人工的変種」は、配列番号１もしくは配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列の修飾ポリヌクレオチド配列又はその相同配列を発現する生物により産生される、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを意味する。修飾ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号３に開示されたポリヌクレオチド配列又はその相同配列の修飾により、ヒトの介入により得られる。]
[0059] 発明の詳細な説明
セルロース分解増強活性を有するポリペプチド
第１の態様において本発明は、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドとの同一性の程度が、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドに関する（以後「相同的ポリペプチド」）。好適な態様において相同的ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドとは、１０個のアミノ酸、好ましくは５個のアミノ酸、さらに好ましくは４個のアミノ酸、さらに好ましくは３個のアミノ酸、最も好ましくは２個のアミノ酸、そしてさらに最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。]
[0060] 本発明のポリペプチドは、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。別の好適な態様においてポリペプチドは配列番号２の成熟ポリペプチドを含む。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８〜２３２、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８〜２３２を含む。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドからなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８〜２３２、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８〜２３２からなる。]
[0061] 本発明のポリペプチドは、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。別の好適な態様においてポリペプチドは配列番号４の成熟ポリペプチドを含む。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１６〜２３５、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１６〜２３５を含む。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチドからなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１６〜２３５、又はそのアレレ変種、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好適な態様においてポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１６〜２３５からなる。]
[0062] 第２の態様において本発明は、好ましくは超低厳密性条件下で、さらに好ましくは低厳密性条件下で、さらに好ましくは中厳密性条件下で、さらに好ましくはやや高厳密性条件下で、さらに好ましくは高厳密性条件下で、そして最も好ましくは超高厳密性条件下で、（ｉ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に含まれるｃＤＮＡ配列と、（iii）（ｉ）もしくは（ii）のサブ配列と、又は（iv）（i）、（ii）、もしくは（iii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドに関する（Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York）。配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、又は好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含む。さらにサブ配列は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドフラグメントをコードしてもよい。好適な態様において相補鎖は、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列の完全長相補鎖である。]
[0063] 配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列又はそのサブ配列、ならびに配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当該分野で公知の方法に従って異なる属又は種の株から、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定しクローン化するための核酸プローブを設計するのに使用される。特にこのようなプローブは、対応する遺伝子を同定し単離するために、標準的サザンブロッティング法に従って、目的の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用することができる。このようなプローブは、全配列よりはるかに短かくてもよいが、少なくとも１４ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３５ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくと７０ヌクレオチドの長さでなければならない。しかし核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチドの長さであることが好ましい。例えば核酸プローブは、少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくと５００ヌクレオチドの長さでもよい。さらに長いプローブを使用してもよく、例えば好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくと８００ヌクレオチドの長さでもよい。ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブの両方とも使用することができる。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するために（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）標識される。かかるプローブは本発明に包含される。]
[0064] 従ってこのような他の株から調製されるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上記プローブとハイブリダイズし、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされる。このような他の株からのゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離法により分離される。ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の適切な担体物質上に転移及び固定化される。配列番号１又は配列番号３と相同的なクローンもしくはＤＮＡ又はそのサブ配列を同定するために、担体物質は好ましくはサザンブロットで使用される。]
[0065] 本発明の目的においてハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列が、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列；配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に含まれるｃＤＮＡ配列；その完全長相補鎖；又はサブ配列に対応する標識核酸プローブに、超低厳密性条件〜超高厳密性条件下でハイブリダイズすることを示す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムを使用して検出することができる。]
[0066] 好適な態様において核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好適な態様において核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド５２〜９２１である。別の好適な態様において核酸プローブは、配列番号２のポリペプチド又はそのサブ配列をコードするポリヌクレオチド配列である。別の好適な態様において核酸プローブは、配列番号１である。別の好適な態様において核酸プローブは、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８３に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９０中に含まれるポリヌクレオチド配列であり、ここでそのポリヌクレオチド配列はセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好適な態様において核酸プローブは、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８３に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９０中に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。]
[0067] 別の好適な態様において核酸プローブは、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好適な態様において核酸プローブは、配列番号３のヌクレオチド４６〜８５１である。別の好適な態様において核酸プローブは、配列番号４又はそのサブ配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好適な態様において核酸プローブは配列番号３である。別の好適な態様において核酸プローブは、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８５に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９２中に含まれるポリヌクレオチド配列であり、ここでそのポリヌクレオチド配列はセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好適な態様において核酸プローブは、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８３に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９２中に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。]
[0068] 少なくとも１００ヌクレオチドの長さの長いプローブについて、超低〜超高厳密性条件は、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００μg/mlの剪断分解及び変性サケ精子ＤＮＡ中で、及び超低及び低厳密性用に２５％ホルムアミド、中〜高厳密性用に３５％ホルムアミド、高及び超高厳密性用に５０％ホルムアミド中で、標準的サザンブロッティング法に従う最適には１２〜２４時間の、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして規定される。]
[0069] 少なくとも１００ヌクレオチドの長さの長いプローブについて、担体物質は最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを使用して、好ましくは４５℃（超低厳密性）、さらに好ましくは５０℃（低厳密性）、さらに好ましくは５５℃（中程度厳密性）、さらに好ましくは６０℃（中程度〜高厳密性）、さらに好ましくは６５℃（高厳密性）、最も好ましくは７０℃（超高厳密性）で、各１５分で３回洗浄される。]
[0070] 約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブについて、厳密性条件は、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）、６mMＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１×デンハルツ溶液、１mMピロリン酸ナトリウム、１mMリン酸一ナトリウム、０．１mMＡＴＰ、及び０．２mg/mlの酵母ＲＮＡ中で、Bolton and McCarthy（1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390）の計算を使用して計算されるＴｍより約５℃〜約１０℃低い温度で、標準的サザンブロッティング法に従う最適には１２〜２４時間のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄ポストハイブリダイゼーションとして規定される。]
[0071] 約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブについて、担体材料は、６×ＳＳＣと０．１％ ＳＤＳを使用して１５分で１回洗浄され、６×ＳＳＣを使用して計算されたＴｍより５℃〜１０℃低い温度で各１５分で２回洗浄される。]
[0072] 第３の態様において本発明は、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はこれからなり、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされる、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドに関する。]
[0073] 第４の態様において本発明は、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチド又はその相同配列の、１つ又はそれ以上（数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む人工的変種に関する。好ましくはアミノ酸の変化は、小さいものであり、すなわちタンパク質の折り畳み及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換；典型的には１〜約３０アミノ酸の小さい欠失；小さなアミノ末端又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基；約２０〜２５残基の小さいリンカーペプチド；又は正味荷電もしくは他の機能（例えばポリヒスチジン区域、抗原性エピトープもしくは結合ドメイン）を変化させることにより精製を促進する小さい伸長である。]
[0074] 保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）の群内である。一般に比活性を変化させないアミノ酸置換は当該分野で公知であり、例えばH. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New Yorkに記載されている。最も一般的に存在する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。]
[0075] ２０個の標準的アミノ酸以外に、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びアルファメチオニンセリン）を、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基の代わりに使用してもよい。アミノ酸残基の代わりに、限定された数の非保存的アミノ酸（遺伝コードでコードされないアミノ酸）及び非天然アミノ酸を使用してもよい。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾されているか、及び／又は標準的アミノ酸とは異なる化学構造を側鎖中に有する。非天然アミノ酸は、化学的に合成することができ、好ましくは市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、及び３，３−ジメチルプロリンがある。]
[0076] あるいはアミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的性質が改変されるようなものである。例えばアミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を改良し、基質特異性を改変し、最適ｐＨを変化させることなどがある。]
[0077] 親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、当該分野で公知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085）により同定することができる。後者の方法において分子のすべての残基で単一のアラニン変異が導入され、分子の活性に決定的に重要なアミノ酸残基を同定するために、得られる変異分子が生物活性（すなわち、セルロース分解増強活性）について試験される。また、Hilton et al.、1996, J. Biol. Chem. 271:4699-4708を参照。酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用はまた、核磁気共鳴、結晶解析、電子回折、又は光親和性標識のような方法に推定接触部位アミノ酸の変異を組合せるような、物理的構造分析により測定される。例えば、Vos et al., 1992, Science 255:306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBSLett. 309:59-64を参照。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドと関連するポリペプチドとの同一性の解析から推定できる。]
[0078] 単一の又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を行い、公知の突然変異誘発法、組換え、及び／又はシャフリングを行い、次に関連するスクリーニング法（例えば、Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156; ＷＯ９５／１７４１３号；又はＷＯ９５／２２６２５号に開示された方法）を使用して試験することができる。使用できる他の方法には、誤りが出やすいＰＣＲ、ファージ表示（例えば、Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; 米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127）がある。]
[0079] 突然変異誘発／シャフリング法は、宿主細胞に発現されるクローン化され突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高処理能力自動スクリーニング法と組合せることができる（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17:893-896）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は宿主細胞から回収し、当該分野で公知の標準的方法を使用して迅速に配列決定することができる。これらの方法は、目的のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な測定を可能にし、未知の構造のポリペプチドに応用することができる。]
[0080] 配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の総数は、１０、好ましくは９、さらに好ましくは８、さらに好ましくは７、さらに好ましくは６、さらに好ましくは５、さらに好ましくは４、さらに好ましくは３、最も好ましくは２、そしてさらに最も好ましくは１である。]
[0081] セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの供給源
本発明のポリペプチドは、任意の属の微生物から得られる。本発明の目的において、ある供給源に関連して本明細書で使用される用語「から得られる」は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、その供給源により、又はその供給源からのヌクレオチド配列が挿入されている菌株により産生されることを意味する。好適な態様において、ある供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。]
[0082] 本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、細菌のポリペプチドでもよい。例えばポリペプチドは、グラム陰性菌のポリペプチド、例えばセルロース分解増強活性を有するバシルス（Bacillus）、連鎖球菌（Streptococcus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、腸球菌（Enterococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、ゲオバシルス（Geobacillus）、又はオセアノバシルス（Oceanobacillus）のポリペプチド、又はセルロース分解増強活性を有する大腸菌（E. coli）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、キャンピロバクター（Campylobacter）、ヘリコバクター（Helicobacter）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、イリオバクター（llyobacter）、ナイセリア（Neisseria）、又はウレアプラズマ（Ureaplasma）のポリペプチドでもよい。]
[0083] 好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するバシルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バシルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バシルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バシルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バシルス・レンタス（Bacillus lentus）、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バシルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシラス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）のポリペプチドである。]
[0084] 別の好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するストレプトコッカス・エキシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、又はストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミクス（Zooepidemicus）のポリペプチドである。]
[0085] 別の好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するストレプトミセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のポリペプチドである。]
[0086] 本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドはまた真菌ポリペプチドであり、さらに好ましくは酵母ポリペプチド、例えばセルロース分解増強活性を有するカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア（Yarrowia）のポリペプチド、さらに好ましくは糸状菌ポリペプチド、例えば、セルロース分解増強活性を有するアクレモニウム（Acremonium）、アガリクス（Agaricus）、アルテルナリア（Alternarta）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ボトリオスペリア（Botryospaeria）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、ケトミジウム（Chaetomidium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、クラビセプス（Claviceps）、コクリオボルス（Cochliobolus）、コプリノプシス（Coprinopsis）、コプトテルメス（Coptotermes）、コリナスカス（Corynascus）、クリホネクトリア（Cryphonectria）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、ディプロジア（Diplodia）、エキシジア（Exidia）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、ホロマスチゴトイデス（Holomastigotoides）、フミコーラ（Humicola）、イルペックス（Irpex）、レンチヌラ（Lentinula）、レプトスペリア（Leptospaeria）、マグナポルテ（Magnaporthe）、メラノカルプス（Melanocarpus）、メリピルス（Meripilus）、ムコール（Mucor）、ミセリフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ノイロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、フェネロケテ（Phanerochaete）、ピロミセス（Piromyces）、ポイトラシア（Poitrasia）、シュードプレクタニア（Pseudoplectania）、シュードトリコニムファ（Pseudotrichonympha）、リゾムコール（Rhizomucor）、シゾフィルム（Schizophyllum）、シタリジウム（Scytalidium）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トリコデルマ（Trichoderma）、トリコフェア（Trichophaea）、ベルチシリウム（Verticillium）、ボルバリエラ（Volvariella）、又はキシラリア（Xylaria）のポリペプチドでもよい。]
[0087] 好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するサッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ダグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）のポリペプチドである。]
[0088] 別の好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するアクレモニウム・セルロリチクス（Acremonium cellulolyticus）、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フェチヅス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニーヅランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、麹菌（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランヂクム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルークウェレンセ（Fusartum crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusartum culmorum）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクラツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロセウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブシヌム（Fusartum sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusartum sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベエナツム（Fusarium venenatum）、フミコーラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ランギノーサ（Humicola lanuginosa）、イルペックス・ラクテウス（Irpex lacteus）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケテ・クリソスポルツム（Phanerochaete chrysosportum）、チエラビア・アクロマチカ（Thielavia achromatica）、チエラビア・アルボミセス（Thielavia albomyces）、チエラビア・アルボピロサ（Thielavia albopilosa）、チエラビア・アウストラレインシス（Thielavia australeinsis）、チエラビア・フィメティ（Thielavia fimeti）、チエラビア・ミクロスポラ（Thielavia microspora）、チエラビア・オビスポラ（Thielavia ovispora）、チエラビア・ペルビアナ（Thielavia peruviana）、チエラビア・スペデドニウム（Thielavia spededonium）、チエラビア・セトーサ（Thielavia setosa）、チエラビア・スブテルモフィラ（Thielavia subthermophila）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）のポリペプチドである。]
[0089] 別の好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するミセリオフトラ・ヒヌレア（Myceliophthora hinnulea）、ミセリオフトラ・ルテア（Myceliophthora lutea）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、又はミセリオフトラ・ベレレア（Myceliophthora vellerea）のポリペプチドである。]
[0090] より好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）のポリペプチドである。最も好適な態様においてポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ＣＢＳ２０２．７５ポリペプチド、例えば配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドを含むポリペプチドである。]
[0091] 上記の種について本発明は、これらが知られている名前に無関係に、完全又は不完全状態、及び他の分類上の同等物、例えばアナモルフ（anamorpho）を含むことは理解されるであろう。当業者は、適切な同等物の本体を容易に認識するであろう。]
[0092] これらの種の株は、多くの菌株保存機関、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（ＤＳＭ）、オランダ微生物株保存センター（Centraalbureau voor Schimmelcultures）（ＣＢＳ）、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Service Patent Culture Collection）、ノーザン・リジョナル・リサーチ・センター（Northern Regional Research Center）（ＮＲＲＬ）で公に容易に入手できる。]
[0093] さらにこのようなポリペプチドは同定され、上記プローブを使用して自然から単離された微生物を含む他の供給源（例えば、土壌、コンポスト、水など）から得られる。自然の環境から微生物を単離する方法は、当該分野で公知である。次に、そのような微生物のゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることにより、ポリヌクレオチドが得られる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、プローブを用いていったん検出されると、当業者に公知の方法を使用してポリヌクレオチドが単離又はクローン化される（例えば、Sambrook et al., 1989、前述参照）。]
[0094] 本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチド又はそのフラグメントのＮ末端又はＣ末端に別のポリペプチドが融合した融合ポリペプチドもしくは切断可能融合ポリペプチドを含む。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその一部）を、本発明のヌクレオチド配列（又はその一部）に融合することにより産生される。融合ポリペプチドの製造法は当該分野で公知であり、コード配列がフレーム内に有り、かつ融合ポリペプチドの発現が同じプロモーターとターミネーターの制御下にあるように、ポリペプチドをコードするコード配列を連結することを含む。]
[0095] 融合ポリペプチドはさらに、切断部位を含んでよい。融合タンパク質の分泌により、その部位が切断されて、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが融合タンパク質から放出される。切断部位の例には、特に限定されないが、ジペプチドをコードするＫｅｘ２部位（Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-76;Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; 及び Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381）、Ｉｌｅ−（Ｇｌｕ 又はＡｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ部位（これはアルギニン残基の後で第Ｘａ因子プロテアーゼにより切断される）（Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512); Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ部位（これはリジンの後でエンテロキナーゼにより切断される）（Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987）；Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ部位、又はＨｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ部位、これはゲネナーゼＩ（ＧｅｎｅｎａｓｅＩ）により切断される（Carter et al., 1989, Proteins, Structure. Function, and Genetics 6: 240-248）；Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ部位（これはＡｒｇの後でトロンビンにより切断される）（Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48); Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ部位（これはＧｌｎの後でＴＥＶプロテアーゼにより切断される）（Stevens, 2003, 前述）；及び Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ部位（これは、Ｇｌｎの後でヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼの遺伝子工学作成型により切断される）（Stevens, 2003, 前述）がある。]
[0096] ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれからなる単離されたポリヌクレオチドに関する。]
[0097] 好適な態様においてヌクレオチド配列は、配列番号１を含むか又はこれからなる。さらに別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８３に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９０中に含まれる配列を含むか又はこれからなる。別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列を含むか又はこれからなる。別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５２〜９２１を含むか又はこれからなる。さらに別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８３に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９０中に含まれる成熟ポリペプチドコード配列を含むか又はこれからなる。]
[0098] 好適な態様においてヌクレオチド配列は、配列番号３を含むか又はこれからなる。さらに別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８５に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９２中に含まれる配列を含むか又はこれからなる。別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列を含むか又はこれからなる。別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド４６〜８５１を含むか又はこれからなる。さらに別の好適な態様においてヌクレオチド配列は、大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８５に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９２中に含まれる成熟ポリペプチドコード配列を含むか又はこれからなる。]
[0099] 本発明はまた、遺伝コードの縮重のために、配列番号１もしくは配列番号３又はこれらの成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号２もしくは配列番号４又はこれらの成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか又はこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。本発明はまた、それぞれセルロース分解増強活性を有する配列番号２又は配列番号４のフラグメントをコードする、配列番号１もしくは配列番号３のサブ配列に関する。]
[0100] 本発明はまた、配列番号１もしくは配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に少なくとも１つの変異を含むか又はこれからなる変異ポリヌクレオチド（ここで変異ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２もしくは配列番号４の成熟ポリペプチドをコードする）に関する。]
[0101] ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローン化するのに使用される方法は当該分野で公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はこれらの組合せを含む。そのようなゲノムＤＮＡからの本発明のポリヌクレオチドのクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用して、共通の構造的特徴を有するクローン化されたＤＮＡフラグメントを検出することにより行われる。例えば、Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methodsand Application, Academic Press, New Yorkを参照。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）、及びヌクレオチド配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）のような他の核酸増幅法も使用される。ポリヌクレオチドは、ミセリオフトラ（Myceliophthora）の株又は他のもしくは関連する微生物からクローン化され、従って例えば、ヌクレオチド配列のポリペプチドをコードする領域のアレレ変種もしくは種変種でもよい。]
[0102] 本発明はまた、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はこれからなり、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。]
[0103] 本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の修飾は、このポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドの合成に必要なことがある。ポリペプチドと「実質的に類似」という用語は、ポリペプチドの非天然型を意味する。これらのポリペプチドは、ある工学作成的意味で、天然供給源から単離されるポリペプチドとは異なり、例えば比活性、熱安定性、最適ｐＨなどが異なる人工的変種である。変種配列は、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列として提示されるヌクレオチド配列（例えばそのサブ配列）に基づいて、及び／又はヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの別のアミノ酸配列を与えないが酵素の産生を目的とした宿主生物のコドン使用に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を与えるヌクレオチド置換の導入により、構築される。ヌクレオチド置換の一般的説明については、例えばFord et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107を参照。]
[0104] かかる置換は、分子の機能に決定的に重要な領域の外で行われ、それでも活性ポリペプチドが得られることは、当業者に明らかであろう。本発明の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性に必須のアミノ酸残基、従って好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当該分野で公知方法、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham and Wells, 1989, 前述）に従って同定される。後者の方法において分子のすべての陽性荷電残基で変異が導入され、得られる変異分子が、分子の活性に決定的に重要なアミノ酸残基を同定するために生物活性について試験される。基質−酵素相互作用の部位もまた、核磁気共鳴、結晶解析、又は光親和性標識のような方法により決定される３次元構造の解析により決定される（例えば、de Vos et al., 1992, 前述; Smith et al., 1992, 前述; Wlodaver et al., 1992, 前述、を参照）。]
[0105] 本発明はまた本明細書に記載のように、超低厳密性条件下で、好ましくは低厳密性条件下で、さらに好ましくは中厳密性条件下で、さらに好ましくはやや高厳密性条件下で、さらに好ましくは高厳密性条件下で、そして最も好ましくは超高厳密性条件下で、（ｉ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に含まれるｃＤＮＡ配列と、（iii）（ｉ）もしくは（ii）の完全長相補鎖とハイブリダイズする、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、又はそのアレレ変種とサブ配列に関する（Sambrook, 1989、前述）。好適な態様において相補鎖は、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列の完全長相補鎖である。]
[0106] 本発明はまた、（ａ）ＤＮＡ集団を、超低、低、中、やや高、高、又は超高厳密性条件下で、（ｉ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に含まれるｃＤＮＡ配列と、（iii）（ｉ）もしくは（ii）の完全長相補鎖とハイブリダイズさせ、そして（ｂ）ハイブリダイズするポリヌクレオチド（これはセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする）を単離することにより得られる。好適な態様において相補鎖は、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列の完全長相補鎖である。]
[0107] 核酸構築体
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で適切な宿主細胞中で、コード配列の発現を指令する１つ又はそれ以上（数個）の制御配列に機能できる形で結合した、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築体に関する。]
[0108] 本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、種々の方法で操作されてポリペプチドを発現させる。発現ベクターによっては、ベクターへの挿入の前にポリヌクレオチド配列の操作が好ましいか又は必要なことがある。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチド配列を修飾する方法は、当該分野で公知である。]
[0109] 制御配列は、適切なプロモーター配列、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列でもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、選択された宿主細胞（変異プロモーター、末端切断型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含む）中で転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。]
[0110] 特に細菌宿主細胞中で本発明の核酸構築体の転写を指令するための適切なプロモーターの例は、大腸菌（E. coli）ｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、枯草菌（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成性アミラーゼ（ａｍｙＭ）、バシルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）アルファアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、枯草菌（Bacillus subtilis）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、及び原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al. 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731）、ならびにｔａｃプロモーター（DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25）から得られるプロモーターである。さらなるプロモーターは、「組換え細菌からの有用なタンパク質」、Scientific American, 1980, 242:74-94; 及びSambrook et al., 1989、前述、に記載されている。]
[0111] 糸状菌宿主細胞中で本発明の核酸構築体の転写を指令するための適切なプロモーターの例は、麹菌（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アルファ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定性アルファ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、麹菌（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、麹菌（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニーズランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（ＷＯ００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Ｄａｒｉａ（ＷＯ００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Ｑｕｉｎｎ（ＷＯ００／５６９００号）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７号）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）ベータグルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ，トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）ベータ−キシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アルファ−アミラーゼと麹菌（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）；及びその変異体、末端切断型、及びハイブリッドプロモーターである。]
[0112] 酵母宿主において有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488に記載されている。]
[0113] 制御配列はまた、宿主細胞により認識されて転写を停止させる配列である適切な転写停止配列でもよい。停止配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に機能できる形で結合している。選択された宿主細胞中で機能する任意のターミネーターが本発明で使用される。]
[0114] 糸状菌宿主細胞の好適なターミネーターは、麹菌（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニーズランス（Aspergillus nidulans）アントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アルファ−グルコシダーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。]
[0115] 酵母宿主細胞の好適なターミネーターは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素の遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なターミネーターは、Romanos et al., 1992, 前述、に記載されている。]
[0116] 制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である適切なリーダー配列でもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に機能できる形で結合している。選択された宿主細胞中で機能する任意のリーダー配列が、本発明で使用される。]
[0117] 糸状菌宿主細胞の好適なリーダーは、麹菌（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、及びアスペルギルス・ニーズランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。]
[0118] 酵母宿主細胞の適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子、及びサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール脱水素酵素／グリセロアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。]
[0119] 制御配列はまた、ヌクレオチド配列の３’末端に機能できる形で結合した配列であり、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして、宿主細胞により認識されるポリアデニル化配列でもよい。]
[0120] 糸状菌宿主細胞の好適なポリアデニル化配列は、麹菌（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニーズランス（Aspergillus nidulans）アントラニレートシンターゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニーズランス（Aspergillus nidulans）アルファ−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。]
[0121] 酵母宿主細胞の適切なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990に記載されている。]
[0122] 制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けるシグナルペプチドコード配列でもよい。ヌクレオチド配列のコード配列の５’末端は、翻訳読みとり枠中で、分泌されるポリペプチドをコードするコード配列のセグメントに天然で結合しているシグナルペプチドコード配列を本来含有する。あるいはコード配列の５’末端は、コード配列に対して異種であるシグナルペプチドコード配列を含有してもよい。この異種シグナルペプチドコード配列は、コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合、必要となることがある。あるいは異種シグナルペプチドコード配列は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード配列を単に置換してもよい。しかし選択された宿主細胞の分泌経路（すなわち、培養培地への分泌）へ発現されたポリペプチドを指令する任意のシグナルペプチドコード配列が、本発明で使用される。]
[0123] 細菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード配列は、バシルス（Bacillus）ＮＣＩＢ １１８３７マルトース生成性アミラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）アルファ−アミラーゼ、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ズブチリシン（subtilisin）、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ベータ−ラクタマーゼ、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｆＳ、ｎｐｒＭ）、及び枯草菌（Bacillus subtilis）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137に記載されている。]
[0124] 糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、麹菌（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶ、及びフミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。]
[0125] 酵母宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子及びサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Romanos et al., 1992, 前述、に記載されている。]
[0126] 好適な態様においてシグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１７を含むか又はこれからなる。別の好適な態様においてシグナルペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜５１を含むか又はこれからなる。]
[0127] 別の好適な態様においてシグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜１５を含むか又はこれからなる。別の好適な態様においてシグナルペプチドコード配列は、配列番号３のヌクレオチド１〜４５を含むか又はこれからなる。]
[0128] 制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード配列でもよい。生じるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又はある場合にはチモーゲン）として知られている。プロペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドから、プロペプチドの触媒性もしくは自己触媒性切断により成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード配列は、枯草菌（Bacillus subtilis）アルカリ性ホスファターゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌（Bacillus subtilis）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びマイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophilia）ラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３６号）の遺伝子から得られる。]
[0129] シグナルペプチドとプロペプチド配列との両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のアミノ末端の隣に位置する。]
[0130] 宿主細胞の増殖に対して、ポリペプチドの発現を制御を可能にする制御配列を付加することが好ましいことがある。制御系の例は、化学的又は物理的刺激（制御化合物の存在を含む）に応答して遺伝子発現をオン又はオフさせるものである。原核細胞系の制御系には、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレーター系がある。酵母ではＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用される。]
[0131] 糸状菌ではＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、及び麹菌（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターが、制御配列として使用される。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では制御配列には、メソトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子がある。これらの場合に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は制御配列に機能できる形で結合しているであろう。]
[0132] 発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、及び転写と翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。本明細書に記載の種々の核酸と制御配列は連結されて組換え発現ベクターが作成され、これは、１つ又はそれ以上（数個）の便利な認識部位を含有して、そのような部位で、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にする。あるいは本発明のポリヌクレオチドは、この配列を含むヌクレオチド配列又は核酸構築体を、発現用の適切なベクターに挿入することにより発現される。発現ベクターの作成においてコード配列は、発現用の適切な制御配列と機能できる形で結合するように、ベクター中に位置する。]
[0133] 組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ法を受けることができ、ヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは線状プラスミドでも閉じた環状プラスミドでもよい。]
[0134] ベクターは、自律的複製性ベクター（すなわち、染色体外物質として存在し、その複製が染色体複製に依存しない）、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体でもよい。ベクターは自己複製を確実にする手段を含む。あるいはベクターは、宿主細胞中に導入された時に、ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれている染色体とともに複製されるものでもよい。さらに宿主細胞のゲノムに総ＤＮＡを一緒に含有する、単一のベクターもしくはプラスミド又は２つもしくはそれ以上のベクターもしくはプラスミドもしくはトランスポゾンが使用される。]
[0135] 本発明のベクターは好ましくは、形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けた細胞の容易な選択を可能にする１つ又はそれ以上（数個）の選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その生成物が、殺生物剤耐性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性を与える遺伝子である。]
[0136] 細菌性選択マーカーの例は、枯草菌（Bacillus subtilis）もしくはバシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性（例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性）を付与するマーカーである。酵母宿主細胞の適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞で使用される選択マーカーには、特に限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミドダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイル転移酵素）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェート脱炭酸酵素）、ｓＣ（硫酸アデニル転移酵素）、及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、ならびにこれらの同等物がある。アスペルギルス（Aspergillus）細胞での使用に好適なものは、アスペルギルス・ニーズランス（Aspergillus nidulans）又は麹菌（Aspergillus oryzae）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子である。]
[0137] 本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込み、又は遺伝子に依存しない細胞中のベクターの自律複製を可能にする要素を含有する。]
[0138] 宿主細胞ゲノムへの組み込みのために、ベクターは、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの組み込みのために、ポリペプチド又はベクターの他の要素をコードするポリヌクレオチドの配列に依存する。あるいはベクターは、染色体中の正確な位置で宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる組み込みを指令する追加のヌクレオチド配列を含んでよい。正確な位置での組み込み確率を上げるために、組み込み要素は好ましくは充分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対を有し、これは、相同的組換えの確率を上昇させるために、対応する標的配列と高度の同一性を有する。組み込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的である任意の配列である。さらに組み込み要素は、非コード又はコードヌクレオチド配列である。一方ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。]
[0139] 自律複製のためにベクターは、ベクターが問題の宿主細胞中に自律的に複製することを可能にする複製開始点をさらに含んでよい。複製開始点は、細胞中で機能する自律的複製を仲介する任意のプラスミドレプリケータでもよい。本明細書において用語「複製開始点」又は「プラスミドレプリケータ」は、プラスミド又はベクターがインビボで複製することを可能にするヌクレオチド配列として規定される。]
[0140] 細菌性複製開始点の例は、大腸菌（E. coli）中での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４と、バシルス（Bacillus）中での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１の複製開始点である。]
[0141] 酵母宿主細胞で使用される複製開始点の例は、２ミクロン複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。]
[0142] 糸状菌細胞で有用な複製開始点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１である（Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic AcidsResearch, 15:9163-9175; ＷＯ００／２４８８３号）。ＡＭＡ１遺伝子の単離とこの遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、ＷＯ００／２４８８３号に記載された方法に従って行われる。]
[0143] 遺伝子産物の産生を上昇させるために、本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞に挿入してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の上昇は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むか、又はポリヌクレオチドを有する増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることにより得ることができる（ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従ってポリヌクレオチドの追加のコピーを含む細胞は、適切な選択剤の存在下で細胞を培養することにより選択することができる）。]
[0144] 上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される方法は、当業者に公知である（例えば、Sambrook et al., 1989、前述、参照）。]
[0145] 宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含み、ポリペプチドの組換え産生に有利に使用される組換え宿主細胞に関する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ベクターが、染色体組み込み体又は前記の自己再生性染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に起きる変異のために、親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は大体、ポリペプチドをコードする遺伝子とその供給源に依存する。]
[0146] 宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え産生に有用な任意の細胞（例えば、原核生物又は真核生物）である。]
[0147] 原核生物宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌である。グラム陽性細菌には、特に限定されないが、バシルス（Bacillus）、連鎖球菌（Streptococcus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、腸球菌（Enterococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、ゲオバシラス（Geobacillus）、及びオセアノバシルス（Oceanobacillus）がある。グラム陰性細菌には、特に限定されないが、大腸菌（E. coli）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、キャンピロバクター（Campylobacter）、ヘリコバクター（Helicobacter）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、イリオバクター（llyobacter）、ナイセリア（Neisseria）、及びウレアプラズマ（Ureaplasma）がある。]
[0148] 細菌宿主細胞は任意のバシルス（Bacillus）細胞でもよい。本発明の実施で有用なバシルス（Bacillus）細胞には、特に限定されないが、バシルス・アルカロフィルス（Bacillus alkaophilus）、バシルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウジイ（Bacillus calusii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィルムス（Bacillus firmus）、バシラス・ラウタス（Bacillus lautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミルス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、及びバシラス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）細胞がある。]
[0149] 好適な態様において細菌宿主細胞は、バシルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、又は枯草菌（Bacillus subtilis）細胞である。より好適な態様において細菌宿主細胞は、バシルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）細胞である。さらに別の好適な態様において細菌宿主細胞は、バシラス・クラウジイ（Bacillus calusii）細胞である。さらに別の好適な態様において細菌宿主細胞は、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）細胞である。さらに別の好適な態様において細菌宿主細胞は、枯草菌（Bacillus subtilis）細胞である。]
[0150] 細菌宿主細胞はまた、任意の連鎖球菌（Streptococcus）細胞でもよい。本発明の実施に有用な連鎖球菌（Streptococcus）細胞には、特に限定されないが、ストレプトコッカス・エキシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、及びストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミクス（Zooepidemicus）細胞がある。]
[0151] 好適な態様において細菌宿主細胞は、ストレプトコッカス・エキシミリス（Streptococcus equisimilis）細胞である。別の好適な態様において細菌宿主細胞は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）細胞である。別の好適な態様において細菌宿主細胞は、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）細胞である。別の好適な態様において、及びストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミクス（Zooepidemicus）細胞である。]
[0152] 細菌宿主細胞はまた、任意のストレプトミセス（Streptomyces）細胞でもよい。本発明の実施に有用なストレプトミセス（Streptomyces）細胞には、特に限定されないが、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及びストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞がある。]
[0153] 好適な態様において細菌宿主細胞は、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）細胞である。別の好適な態様において細菌宿主細胞は、ストレプトミセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）細胞である。別の好適な態様において細菌宿主細胞は、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）細胞である。別の好適な態様において細菌宿主細胞は、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）細胞である。別の好適な態様において細菌宿主細胞は、及びストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞である。]
[0154] バシラス（Bacillus）細胞へのＤＮＡの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115参照）により、コンピタントな細胞（例えば、Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829、又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221参照）を使用して、電気穿孔法（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751参照）により、又は接合（例えば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5271-5278参照）により、行われる。大腸菌（E. coli）細胞へのＤＮＡの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えば、Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166:557-580）、又は電気穿孔法（例えば、Dower et al., 1988, Nucleic AcidsRes. 16:6127-6145）により、行われる。ストレプトミセス（Streptomyces）細胞へのＤＮＡの導入は、例えばプロトプラスト形質転換と電気穿孔法（例えば、Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49:399-405参照）、接合（例えば、Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171:3583-3585参照）、又は形質導入（例えば、Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6289-6294参照）により行われる。シュードモナス（Pseudomonas）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば電気穿孔法（例えば、Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64:391-397参照）、又は接合（例えば、Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71:51-57参照）により行われる。連鎖球菌（Streptococcus）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば自然のコンピタンス（例えば、Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32:1295-1297参照）、プロトプラスト形質転換（例えば、Catt and Jollick, 1991, Microbios. 68:189-2070参照）、電気穿孔法（例えば、Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65:3800-3804参照）、又は接合（例えば、Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45:409-436参照）により行われる。しかしＤＮＡを宿主細胞に導入するための当該分野で公知の任意の方法が使用できる。]
[0155] 宿主細胞はまた、真核生物、例えば哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞でもよい。]
[0156] 好適な態様において、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書において「真菌」は、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth et al., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, CAB International, Univercity Press, Cambridge, UK、で規定されている）、ならびに卵菌門（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995、前述、171頁に引用）、及び不完全菌類（Hawksworth et al., 1995、前述）を含む。]
[0157] より好適な態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において「酵母」は、有子嚢胞子酵母（ascosporogenous）酵母（エンドミセタレス目（Endomycetales））、担子胞子形成（basidiosporogenous）酵母、および不完全菌類（Fungi lmperfecti）（不完全酵母菌綱（Blastomycetes））に属する酵母を含む。酵母の分類は将来変わる可能性があるため、本発明の目的において、酵母は Biology and Activities of Yeast（Skinner,F.A., Passmore, S. M、およびDavenport, R. R. 編、Soc. App. Bacteriol. 第9回シンポジウム、1980年）に記載のように規定される。]
[0158] より好適な態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞である。]
[0159] 最も好適な態様において、酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ダグラシー（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クリヴェリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス・オヴィフォルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。別の最も好適な態様において、酵母宿主細胞は、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）細胞である。別の最も好適な態様において、酵母宿主細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。]
[0160] 別の好適な態様において、真菌宿主細胞は糸状真菌細胞である。「糸状菌」は、亜門の真菌門（Eumycota）および卵菌門（Oomycota）のすべての糸状形態を含む（Hawksworth et al., 1995、前述、により規定される）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖からなる菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養生長は菌糸体伸長により、炭素の異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母による栄養生長は単細胞葉状体の出芽により、炭素の異化は発酵性であり得る。]
[0161] より好適な態様において、糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビヤーカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオルス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコーラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ノイロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、フェネロケテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プロイロタス（Pleurotus）、シゾフィルム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である。]
[0162] 最も好適な態様において糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニーズランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、又は麹菌（Aspergillus oryzae）細胞である。別の最も好適な態様において、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリディオデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェルエンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラツム（Fusarium reticulatun）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコチロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルプレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルローサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ヴェネナツム（Fusarium venenatum）細胞である。別の最も好適な態様において、糸状真菌宿主細胞は、ビヤーカンデラ・アヅスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・イオプス（Chrysosporium iops）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランジカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオルス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプルゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラビアータ（Phlebia rabiata）、プレウロタス・エリンギイ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシカラー（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギプラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。]
[0163] 真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、およびそれ自体公知の方法で細胞壁の再生を包含するプロセスによって形質転換することができる。アスペルギルス（Aspergillus）とトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞の形質転換に適切な方法は、ＥＰ２３８０２３号およびYeltonら、1984年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474に記載されている。フザリウム（Fusarium）種を形質転換するための適切な方法は、Malardierら、1989年、Gene 78:147-156およびＷＯ９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Becker and Guarente、編者: Abelson, J. N. and Simon, M.I., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methodsin Enzymology、第194巻、182-187頁、Academic Press, Inc., New York；Ito et al., 1983年、Journal of Bacteriology 153:163;ならびにHinnen et al., 1978年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920に記載の方法を使用して、形質転換してもよい。]
[0164] 産生法
本発明はまた本発明のポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）細胞を培養し（ここで、その野生型は、ポリペプチドの産生を促進する条件下でポリペプチドを産生する）、そして（ｂ）ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる方法に関する。好適な態様において細胞は、ミセリオフトラ（Myceliophthora）属である。より好適な態様において細胞は、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）である。最も好適な態様において細胞は、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ＣＢＳ２０２．７５である。別の最も好適な態様において細胞は、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ＣＢＳ１１７．６５である。]
[0165] 本発明はまた、本発明のポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）上記したように、ポリペプチドの産生を促進する条件下で組換え宿主細胞を培養し、そして（ｂ）ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる方法に関する。]
[0166] 本発明はまた、本発明のポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）ポリペプチドの産生を促進する条件下で組換え宿主細胞を培養し（ここで細胞は、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に少なくとも１つの変異を有する変異ヌクレオチド配列を含み、変異ヌクレオチド配列は、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドを含むか又はこれからなるポリペプチドをコードする）、そして（ｂ）ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる方法に関する。]
[0167] 本発明の産生方法では、当該分野で公知の方法を使用して、細胞はポリペプチドの産生に適切な栄養培地中で培養される。例えば細胞は、適切な培地中で、ならびにコード配列を発現させるおよび／またはポリペプチドを単離することが可能な条件下で、実験室あるいは工業的発酵槽において振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、もしくは固相発酵を含む）によって培養することができる。培養は、当該分野において公知の方法を使用して、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄養培地において行われる。適切な培地は販売者から入手可能であり、または（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）のカタログに）公開された組成に従って、調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物から回収することができる。]
[0168] ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的である当該分野において既知の方法を使用して、検出することができる。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の生成、または酵素基質の消失を含んでよい。例えば、本明細書に記載のポリペプチドの活性を測定するために、酵素アッセイが使用される。]
[0169] 得られるポリペプチドは、当該分野において既知の方法によって回収することができる。例えば、ポリペプチドは、特に限定されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、または沈殿を含む従来の方法によって、栄養培地から回収することができる。]
[0170] 本発明のポリペプチドは、特に限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、差分溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えば、Protein Purification、編者:J.-C. Janson and Lars Ryden,VCH Publishers, New York, 1989を参照）を含む当該技術分野で公知の様々な方法によって、精製することができる。]
[0171] 植物
本発明はまた、ポリペプチドを回収可能な量で発現し産生するように、本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む植物、例えばトランスジェニック植物、植物の部分、又は植物細胞に関する。ポリペプチドは、植物又は植物の部分から回収される。あるいは、組換えポリペプチドを含有する植物又は植物の部分は、食物や飼料の品質を改良するために、例えば栄養価、嗜好性、流動性を改良するために、又は栄養分吸収阻害因子を破壊するために使用される。]
[0172] トランスジェニック植物は、双子葉植物（dicot）でも単子葉植物（monocot）でもよい。単子葉植物の例は、草、例えば牧草（イチゴツナギ（blue grass）、Poa）、飼料草、例えばウシノケグサ（Festuca）、ライグラス（Lolium）、温帯の草（例えばヌカボ（Agrostis））、及び穀類、例えば小麦、オート麦、ライ麦、大麦、イネ、モロコシ、及びトウモロコシ（corn）である。]
[0173] 双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物（例えばルピナス、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、インゲン、及び大豆）、及びアブラナ科植物（Brassicaceae科）（例えばカリフラワー、菜種、及び密接に関連するモデル生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））である。]
[0174] 植物の部分の例は、茎、カルス、葉、根、果実、種子、及び塊茎、及びこれらの部分を含む個々の組織（例えば、表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織）である。特定の植物細胞コンパートメント（例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、及び細胞質）もまた、植物の部分と見なされる。さらに組織の起源に拘わらずすべての植物細胞は、植物の部分と見なされる。同様に本発明の利用を促進するように単離された特定の組織や細胞のような植物の部分（例えば、胚、内胚乳、アリューロン、及び種皮）もまた、植物の部分と見なされる。]
[0175] また本発明の範囲には、かかる植物、植物の部分、及び植物細胞の子孫も含まれる。]
[0176] 本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞はまた、当該分野で公知の方法に従って構築される。簡単に説明すると植物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上（数個）の発現構築体を、植物の宿主ゲノム又は葉緑体ゲノムに取り込み、生じる改変植物又は植物細胞を増殖させて、トランスジェニック植物又は植物細胞にすることにより、構築される。]
[0177] 発現構築体は、植物又は好適な植物の部分中のヌクレオチド配列の発現に必要な適切な制御配列に機能できる形で結合した、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築体であることが便利である。さらに発現構築体は、発現構築体が組み込まれる宿主細胞を、及び問題の植物中に構築体を導入するのに必要なＤＮＡ配列（後者は、使用されるＤＮＡ導入法に依存する）を同定するのに有用な選択マーカーを含んでよい。]
[0178] 制御配列（例えば、プロモーター及びターミネーター配列、及び場合によりシグナル配列又は輸送配列）の選択は、例えばポリペプチドがいつ、どこで、どのように発現されるかにより決定される。例えば本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、構成性でも誘導性でもよく、又は成長特異的、ステージ特異的、又は組織特異的でもよく、遺伝子産物は、特定の組織又は植物の部分（例えば種子又は葉）にターゲティングされてもよい。制御配列は、例えばTague et al., 1988, Plant Physiology 86:506に記載されている。]
[0179] 構成性発現のために、トウモロコシユビキチン１である３５Ｓ−ＣａＭＶ及びイネのアクチン１プロモーターが使用される（Franck et al., 1980, Cell 21:285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3:1155-1165）。器官特異的プロモーターは、例えば保存系組織、例えば種子、ジャガイモ塊茎、及び果実からのプロモーター（Edwardsand Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:275-303）、又は分裂組織のような代謝系組織からのプロモーター（Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24:863-878）、種子特異的プロモーター、例えばイネのグルテリン、プロラミン、グロブリン、又はアルブミンプロモーター（Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39:885-889）、レグミンＢ４からのソラマメ（Vicia faba）プロモーターとソラマメ（Vicia faba）からの未知の種子タンパク質遺伝子（Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152:708-711）、種油体タンパク質からのプロモーター（Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39:935-941）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）からの貯蔵タンパク質ｎａｐＡ、又は当該分野で公知の他の種子特異的プロモーター、例えばＷＯ９１／１４７７２号に記載されたようなものでもよい。さらにプロモーターは、葉特異的プロモーター、例えばイネ又はトマトからのｒｂｃｓプロモーター（Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102:991-1000）、クロレラウイルス（Chlorella Virus）アデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26:85-93）、又はイネからのａｌｄＰ遺伝子プロモーター（Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248:668-674）、又は創傷誘導性プロモーター、例えばジャガイモｐｉｎ２プロモーター（Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22:573-588）でもよい。同様にプロモーターは、温度、渇水、又は塩分の変化のような非生物的処理により誘導されるか、又はプロモーターを活性化する外から加えられる物質［例えば、エタノール、エストロゲン、植物ホルモン（例えば、エチレン、アブシジン酸、及びジベレリン酸）、及び重金属］により誘導されてもよい。]
[0180] プロモーターエンハンサー要素はまた、植物中の本発明のポリペプチドの高発現を達成するのに使用される。例えばプロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に置かれるイントロンでもよい。例えばXu et al., 1993、前述、は、発現を増強するためのイネアクチン１遺伝子の第１イントロンの使用を開示する。]
[0181] 選択マーカー遺伝子と発現構築体の他の部分は、当該分野で入手できるものから選択される。]
[0182] 核酸構築体は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在形質転換、ウイルス介在形質転換、微量注入法、粒子衝撃法、バイオリスティック形質転換、及び電気穿孔法を含む当該分野で公知の通常法に従って、植物ゲノム中に取り込まれる（Gasser et al., 1990, Science 244:1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8:535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338:274）。]
[0183] 現在アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）介在遺伝子輸送が、トランスジェニック双子葉植物を作成するために選択される方法（総説については、Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19:15-38を参照）であり、単子葉植物を形質転換するのにも使用できるが、これらの植物については他の形質転換法もしばしば使用される。現在トランスジェニック単子葉植物を作成するために選択される方法は、胚カルス又は発生胚（Christou, 1992, Plant Journal 2:275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5:158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10:667-674）の粒子衝撃法（形質転換性ＤＮＡで被覆された微細金又はタングステン粒子）である。単子葉植物の形質転換のための別の方法は、Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21:415-428に記載されたようなプロトプラスト形質転換に基づく。]
[0184] 形質転換後、発現構築体を取り込んだ形質転換体が選択され、当該分野で公知の方法に従って再生されて植物体になる。形質転換法はしばしば、例えば２つの異なるＴ−ＤＮＡ構築体を用いる同時形質転換、又は特異的リコンビナーゼによる選択遺伝子の部位特異的切断を使用して、再生中又は以後の世代の選択遺伝子の選択的排除のために計画される。]
[0185] 本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの産生を促進する条件下で、本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し、そして（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明のポリペプチドを産生する方法に関する。]
[0186] セルロース分解増強活性の除去又は低下
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその一部を破壊又は欠失させることを含んでなり、これが、同じ条件下で培養すると親細胞より少ないポリペプチドを産生する変異細胞を与えることを特徴とする、親細胞の変異体を産生する方法に関する。]
[0187] 変異細胞は、当該分野で公知の方法（例えば、挿入、破壊、置換、又は欠失）を使用して、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を低下させるか又は排除することにより構築される。好適な態様においてヌクレオチド配列は、不活性化される。修飾又は不活性化されるヌクレオチド配列は、例えば活性に必須のコード領域又はその一部、又はコード領域の発現に必要な制御要素でもよい。かかる制御配列又は調節配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（すなわち、ヌクレオチド配列の発現に影響を与えるのに充分な部分）でもよい。修飾の可能な他の制御配列には、特に限定されないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター、及び転写アクチベーターがある。]
[0188] ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発に付し、ヌクレオチド配列の発現が低下しているか又は排除されている変異細胞を選択することにより行われる。突然変異誘発（これは特異的でもランダムでもよい）は、例えば、適切な物理的もしくは化学的突然変異誘発剤を使用して、適切なオリゴヌクレオチドを使用して、又はＤＮＡ配列をＰＣＲによる突然変異誘発に付すことにより行われる。さらに突然変異誘発は、これらの突然変異誘発剤の任意の組合せの使用により行われる。]
[0189] 本発明の目的に適した物理的又は化学的突然変異誘発剤の例には、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホニル（ＥＭＳ）、重亜硫酸ナトリウム、蟻酸、及びヌクレオチド類似体がある。]
[0190] かかる物質が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発すべき親細胞を、好適な突然変異誘発剤の存在下で適切な条件下でインキュベートし、スクリーニングし、及び／又は遺伝子の発現が低下しているか又は発現が無い変異細胞を選択することにより行われる。]
[0191] ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、その転写又は翻訳に必要な遺伝子又は制御要素中の１つ又はそれ以上（数個）のヌクレオチドの導入、置換、又は除去により行われる。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又は読みとり枠の変化を引き起こすように、ヌクレオチドが挿入されるか又は除去される。かかる修飾又は不活性化は、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ性突然変異誘発により、当該分野で公知の方法に従って行われる。原則的には修飾はインビボで、すなわち修飾すべきヌクレオチド配列を発現する細胞に直接行われるが、後述するように修飾はインビトロで行うことが好ましい。]
[0192] 細胞によるヌクレオチド配列の発現を排除するか又は低下させるための便利な方法の例は、遺伝子置換、遺伝子欠失、又は遺伝子破壊法に基づく。例えば遺伝子破壊法では、内因性ヌクレオチド配列に対応する核酸配列は、インビトロで突然変異誘発されて欠陥性の核酸配列を産生し、これは次に親細胞に形質転換されて欠陥遺伝子を産生する。相同的組換えにより、欠陥核酸配列は内因性ヌクレオチド配列に取って代わる。欠陥ヌクレオチド配列はまた、ヌクレオチド配列が修飾又は破壊されている形質転換体の選択に使用されるマーカーをコードすることが好ましい。特に好適な態様においてヌクレオチド配列は、本明細書に記載のような選択マーカーを用いて破壊される。]
[0193] あるいはヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、ヌクレオチド配列に相補的な配列を使用して、確立されたアンチセンス法又はＲＮＡｉ法により行われる。さらに詳しくは、細胞内で転写され、細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズできる、遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を導入することにより、細胞によるヌクレオチド配列の発現は低下されるか又は排除され得る。こうして、相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズすることを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量は低下又は排除される。]
[0194] 本発明はさらに、ポリペプチド又はその制御配列をコードするヌクレオチド配列の破壊又は欠失を含む親細胞の変異細胞に関し、これは、親細胞と比較してより少ないかポリペプチドを産生するか又は全く産生しない変異細胞を与える。]
[0195] こうして作成されるポリペプチド欠損変異細胞は、固有の及び／又は異種ポリペプチドの発現のための宿主細胞として特に有用である。すなわち本発明はさらに、（ａ）ポリペプチドの産生を促進する条件下で変異細胞を培養し、そして（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる、固有の又は異種ポリペプチドを産生する方法に関する。本明細書において用語「異種ポリペプチド」は、宿主細胞に固有ではないポリペプチド、固有の配列を改変するように修飾された固有のタンパク質、又は組換えＤＮＡ技術による宿主細胞の操作の結果としてその発現が定量的に変化している固有のタンパク質として定義される。]
[0196] さらなる態様において本発明は、発酵が完了する前、その最中、又は後に発酵ブロスに、セルロース分解増強活性を阻害できる物質の有効量を添加し、発酵ブロスから目的の生成物を回収し、そして回収した生成物を随時さらに精製することにより、本発明のポリペプチドならびに目的のタンパク質生成物を産生する細胞の発酵により、実質的にセルロース分解増強活性が無いタンパク質生成物を産生する方法に関する。]
[0197] さらなる態様において本発明は、生成物の発現を可能にする条件下で細胞を培養し、生じる培養ブロスをｐＨと温度の組合せ処理に付してセルロース分解増強活性を実質的に低下させ、そして培養ブロスから生成物を回収することにより、セルロース分解増強活性が基本的に無いタンパク質生成物を産生する方法に関する。あるいはｐＨと温度の組合せ処理は、培養ブロスから回収される酵素調製物に行っても良い。ｐＨと温度の組合せ処理は場合により、セルロース分解増強インヒビターを用いる処理と組合せて行われる。]
[0198] 本発明のこの態様において、セルロース分解増強活性の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％を除去することが可能である。セルロース分解増強活性の完全な除去はこの方法の使用により行われる。]
[0199] ｐＨと温度の組合せ処理は好ましくは、ｐＨが２〜４又は９〜１１の範囲で、温度が少なくとも６０〜７０℃の範囲で、所望の効果を達成するのに充分な時間（典型的には３０〜６０分で充分である）行われる。]
[0200] 目的の生成物の培養と精製に使用される方法は、公知の方法である。]
[0201] 基本的にセルロース分解増強活性の無い生成物を産生するための本発明の方法は、真核生物ポリペプチド、特に酵素のような真菌タンパク質の産生に関係する。酵素は、例えばデンプン分解酵素、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、酸化還元酵素、又は植物細胞壁分解酵素から選択される。かかる酵素の例には、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノロキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼがある。セルロース分解増強欠損細胞はまた、ホルモン、増殖因子、受容体などの薬理学的関連のある異種タンパク質を発現するために使用される。]
[0202] 用語「真核生物ポリペプチド」は、固有のポリペプチドのみではなく、アミノ酸置換、欠失、もしくは付加、又は活性、熱安定性、ｐＨ耐性などを増強するための他の修飾により修飾されているポリペプチド（例えば酵素）も含むと理解される。]
[0203] さらなる態様において本発明は、本発明の方法により産生されるセルロース分解増強活性が実質的に無いタンパク質生成物に関する。]
[0204] セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの発現を阻害する方法
本発明はまた、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を細胞に投与するか、又はこれを細胞中で発現することを含んでなる、細胞中のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの発現を阻害する方法であって、ｄｓＲＮＡは本発明のポリペプチドのサブ配列を含むことを特徴とする方法に関する。好適な態様においてｄｓＲＮＡは、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上の２本鎖ヌクレオチドの長さである。]
[0205] ｄｓＲＮＡは好ましくは、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。好適な態様においてｄｓＲＮＡは、転写を阻害するための小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。別の好適な態様においてｄｓＲＮＡは、翻訳を阻害するためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。]
[0206] 本発明はまた、細胞中のポリペプチドの発現を阻害するための、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列の一部を含んでなる、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子に関する。本発明は特定の作用機構に限定されるものではないが、ｄｓＲＮＡは細胞に入り、類似の又は同一の配列の１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｍＲＮＡを含む）の分解を引き起こすことができる。細胞がｄｓＲＮＡに曝露されると、相同性遺伝子からのｍＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスにより選択的に分解される。]

权利要求:

請求項1
以下よりなる群から選択されるセルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチド：（ａ）配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）少なくとも中程度の厳密性条件下で、（ｉ）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列中に含まれるｃＤＮＡ配列と、又は（iii）（ｉ）もしくは（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｄ）配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドの１つ又はそれ以上（数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変種。
請求項2
配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列、又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含むか又はこれからなる、請求項１のポリペプチド。
請求項3
大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８３に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９０、又は大腸菌（E. coli）ＮＲＲＬ Ｂ−５００８５に含まれるプラスミドｐＳＭａｉ１９２、に含まれるポリヌクレオチドにコードされる、請求項１のポリペプチド。
請求項4
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
請求項5
発現宿主中のポリペプチドの産生を指令する１つ又はそれ以上（数個）の制御配列に機能できる形で結合した、請求項４のポリヌクレオチドを含む核酸構築体。
請求項6
請求項５の核酸構築体を含む組換え宿主細胞。
請求項7
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）細胞を培養し（ここでその野生型は、ポリペプチドの産生を促進する条件下でポリペプチドを産生する）、そして（ｂ）ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる方法。
請求項8
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）ポリペプチドの産生を促進する条件下で、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築体を含む宿主細胞を培養し、そして（ｂ）ポリペプチドを回収する、ことを含んでなる方法。
請求項9
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊又は欠失させることを含んでなり、これが親細胞より少ないポリペプチドを産生する変異体を与えることを特徴とする、親細胞の変異体を産生する方法。
請求項10
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）ポリペプチドの産生を促進する条件下で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し、そして（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
請求項11
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより形質転換されたトランスジェニック植物、植物の部分、又は植物細胞。
請求項12
請求項４のポリヌクレオチドのサブ配列を含む２本鎖阻害性ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ｄｓＲＮＡは場合によりｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ分子であることを特徴とする分子。
請求項13
２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を細胞に投与するか、又はこれを細胞中で発現することを含んでなる、細胞中のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの発現を阻害する方法であって、ｄｓＲＮＡは、請求項４のポリヌクレオチドのサブ配列を含むことを特徴とする方法。
請求項14
配列番号２のアミノ酸１〜１７又は配列番号４のアミノ酸１〜１５を含むかもしくはこれからなるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に、機能できる形で結合したタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構築体であって、遺伝子はヌクレオチド配列に対して異種であることを特徴とする核酸構築体。
請求項15
請求項１４の核酸構築体を含む組換え宿主細胞。
請求項16
（ａ）タンパク質の産生を促進する条件下で、請求項１５の組換え宿主細胞を培養し、そして（ｂ）タンパク質を回収することを含んでなる、タンパク質の産生方法。
請求項17
請求項１〜３のいずれかのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在下で、セルロース系材料をセルロース分解酵素組成物で処理することを含んでなる、セルロース系材料を分解又は変換するための方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが存在しない場合と比較して、セルロース系材料の分解を上昇させることを特徴とする方法。
請求項18
分解されたセルロース系材料を回収することをさらに含む、請求項１７の方法。
請求項19
発酵生成物を製造する方法であって、（ａ）請求項１〜３のいずれかのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在下で、セルロース系材料をセルロース分解酵素組成物で糖化し（ここで、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが存在しない場合と比較して、セルロース系材料の分解を上昇させる）；（ｂ）工程（ａ）の糖化したセルロース系材料を１つ又はそれ以上の発酵微生物で発酵させて発酵生成物を生成させ、そして（ｃ）発酵物から発酵生成物を回収する、ことを含んでなる方法。
請求項20
セルロース系材料を１つ又はそれ以上の発酵微生物で発酵させることを含んでなるセルロース系材料の発酵方法であって、ここで、セルロース系材料は、請求項１〜３のいずれかのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在下でセルロース分解酵素組成物で加水分解され、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが存在しない場合と比較して、セルロース系材料の加水分解を上昇させる、ことを特徴とする方法。